Studies on AP-1 Sorting Function and Regulation of Membrane Binding

Abstract

Der Adaptor-Protein Komplex 1 (AP-1) vermittelt die Bildung von transportvesikeln am trans-Golgi Netzwerk und ist Bestandteil Clathrin umhüllter transportvesikel. AP-1 vermittelt die Clathrin Bindung an Vesikel und bindet zudem an Sequenzmotive in zytoplasmatischen Domänen von transmembranproteinen. Seine Funktion wird in der Sortierung von Proteinen in Clathrin-transportvesikel gesehen. Der AP-1 Komplex besteht aus 4 Untereinheiten, deren Funktionen für die Proteinsortierung und die Vesikelbildung nur in Teilen verstanden sind. Die beiden grossen Untereinheiten γ1 und β1 bestehen jeweils aus einer N-terminalen globulären Domäne und einer C-terminalen globulären Domäne, die eine Vielzahl von Proteinen binden, deren Funktionen bei der Vesikelbildung nicht verstanden sind. Die μ1A Untereinheit des Komplexes ist essentiel für die Membranbindung des AP-1 und bindet transmembranproteine, die durch den AP-1 Komplex transportiert werden. Mit Ausnahme des β 1 Adaptin existieren von allen Untereinheiten des AP-1 Isoformen, von denen die Mehrzahl gewebsspezifisch expremiert werden. Die Funktionsanalyse von μ2/μ1A-Adaptin Chimären zeigte, dass der Bereich geringster Sequenzhomologie eine Bedeutung für die AP-1 vermittelte Proteinsortierung hat. Die Membranbindung des AP-1 Komplexes mit dem μ2/μ1A Chimären ist stabiler. Mittels des Y2H Verfahrens wurde ein bislang nicht charakterisiertes Protein identifiziert, das mit hoher Affinität und Spezifität an diese Domäne bindet. Seine Überexpression führt zu einer verminderten Membranbindung des AP-1, nicht des chimären Komplexes. Vom σ1-Adaptin existieren drei Isoformen σ1A, σB und σC. Das σ1B transskript wird zudem gewebsspezifisch alternativ gespleisst. Es sollten spezifische Funktionen für σ1 Isoformen identifiziert werden. Da ein γ1 Adaptin Bindemotif in der Isoform σ1B-3 existiert, nicht aber in den anderen, wurde dieses Motif analysiert. Es interagierte nicht mit γ1, jedoch lies sich durch Änderung einer einzigen flankierenden Aminosäure, eine Bindung erreichen.Es wurde die Sortierung des Sortilin Rezeptors in μ1A-sowie σ1B Adaptin-defizienten Zellen untersucht. In μ1A -/- zellen ist Sortilin von seiner normalen trans-Golgi Netzwerk Lokalisation in frühe Endosomen umverteilt. Daraufhin wurde die Bindung zweier Sortierungsmotife des Sortilin überprüft. Das Tyrosin-basierende Motif zeigte eine Interaktion mit dem μ1A Adaptin. Das di-Leucin-basierende Motif zeigte die höchste Affinität zu γ1/σ1B Hemikomplexen. Embryonale Fibroblasten einer σ1B "knock-out" Maus zeigten jedoch keine Sortilinfehlsortierung. Die Interaktion des Sortilins mit μ1A Adaptin scheint daher für eine Sortierung zwischen dem trans-Golgi Netzwerk und Endosomen in diesen Zellen ausreichend zu sein. Adipocyten von σ1B-defizienten Mäusen hatten jedoch eine vierfach höhere Menge an Sortilin. σ1B-Adaptin vermittelt daher in Adipocyten die Sortierung entlang eines gewebsspezifischen transportweges.