Regulation by Glycogen Synthase Kinase-3 Beta of CBP transcriptional coactivator involved in insulin-dependent glucagon gene transcription

Abstract

Das Peptidhormon Glucagon ist der funktionelle Antagonist von Insulin and fördert die Glucose-Freisetzung aus der Leber. Insulin hemmt die Glucagon-Sekretion und die Glucagongen-Transkription. Eine Insulin-Restistenz dagegen führt zu Hyperglucagonämie, die zu der verschlechterten Glucosetoleranz im Diabetes mellitus Typ 2 beiträgt. Ergebnisse früherer Studien führten zu der Annahme, dass bei der Hemmung der Glucagongen-Transkription durch Insulin die Glykogensynthasekinase 3 Beta (GSK3 Beta) beteiligt ist.Der Coaktivator CBP (CREB-Bindprotein), von dem gezeigt wurde, dass er für die Aktivierung der Glucagongen-Transkription essentiell ist, wird durch die GSK3 Beta an seinem C-terminalen Ende phosphoryliert. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Phosphorylierungsstellen, die durch die GSK3 Beta phosphoryliert werden könnten, innerhalb des C-terminalen Endes identifiziert und hinsichtlich ihrer funktionellen Bedeutung für die Regulation der Glukagongen-Transkription charakterisiert.Mit drei C-terminalen Fragmenten des CBPs wurden in vitro-Phosphorylierungen mit rekombinanter GSK3 Beta durchgeführt. Auch ohne vorherige Phosphorylierung durch andere Kinasen phosphorylierte GSK3 Beta ein GST-fusioniertes C-terminales Fragment von CBP, das die Aminosäuren 2300-2441 umfasste. Die Phosphorylierung in vivo wurde durch zwei Methoden untersucht: MALDI-TOF Massenspektrometrie und Immunprezipitation mit phospho-spezifischen Nachweisantikörpern. Beide Methoden waren nicht zum Nachweis der CBP-Phosphorylierung geeignet.Durch eine Computer-gestütze Analyse wurde die GSK3 Beta-Substrat-Erkennungssequenz mit der C-terminalen CBP-Sequenz und der entsprechenden Sequenz des CBP-Homologen p300 verglichen. Die Aminosäuren Serin 2420 und 2424 wurden als potentielle GSK3 Beta -Zielstrukturen identifiziert. Diese Aminosäuren wurden zu Alanin mutiert und die mutierten CBP-Fragmente als GST-Fusionsproteine in in vitro-GSK3 Beta-Phophorylierungsexperimente eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die eingefügten Mutationen die Phosphorylierung des CBP-Fragments 2300-2441 deutlich verringerte.Um die funktionelle Bedeutung der entdeckten GSK3 Beta-Phosphorylierungsstellen zu untersuchen, wurden transiente Transfektionen durchgeführt. CBP, welches das mutierte Serin 2424 enthielt, vermittelte eine signifikant verminderte Aktivierung durch GSK3 Beta der Glucagongen-Transkription. Die CBP-S2420A-Mutante beeinflusste diese Aktivierung der Glukagongen-Transkription nicht. Die Insulin-induzierte Hemmung der transkriptionellen Aktivität von CBP am Glukagongen wurde durch die eingesetzten Mutanten nicht aufgehoben.Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass in CBP Serin 2424 durch die GSK3 Beta in vitro phosphoryliert wird und in vivo die GSK3 Beta-induzierte Aktivierung der Glukagongen-Transkription vermittelt. Die Phosphorylierung durch die GSK3 Beta könnte den Nukleoproteinkomplex am Glukagongen-Promotor stabilisieren. Insulin könnte durch die Hemmung der GSK3 Beta diesen Komplex zerstören und dadurch die Glukagongen-Transkription unterdrücken. Da die Mutation des Serin 2424 nicht ausreichend war, um einen dem Insulin vergleichbaren inhibitorischen Effekt auf die Glukagongen-Transkription auszuüben, existieren vermutlich weitere GSK3 Beta-Phosphorylierungsstellen im CBP.