The importance of charged amino acids in the human Organic Anion Transporter 1
Die funktionelle Bedeutung geladener Aminosäurereste im humanen Organische-Anionen-Transporter 1
by Ahsan Naqi Rizwan
Date of Examination:2007-01-16
Date of issue:2007-02-19
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Burckhardt
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Detlef Doenecke
Persistent Address:
http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B61C-5
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Description:Dissertation
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Abstract
English
The organic anion transporter 1 (OAT1) is key for the secretion of organic anions in renal proximal tubules. However, not much is currently known about structure-activity relationships or substrate-binding and translocation. In this study we investigated the role of conserved charged residues possibly important for substrate binding and turnover of the transporter. Another part of the study sought to characterize the effect of pH, interaction with Krebs cycle intermediates and investigation of the chloride-mediated stimulation of hOAT1. In HEK293 cells stably expressing hOAT1 the relative degree of competitive inhibition of carboxyfluorescein uptake was as follows: alpha-ketoglutarate >succinate >citrate >malate. Removal of chloride markedly slowed down the transporter. Lowering pH from 7.4 to 6.0 during transport experiments increased uptake of PAH and glutarate significantly. Numerous charge conservative and non-conservative replacements were made in cationic residues though site-directed mutagenesis and characterized. Though all mutations resulted in markedly reduced transport function, a conserved, positively charged arginine residue R466 in the 11th transmembrane helix was interesting. The replacement of arginine by the positively charged lysine (R466K) did not impair expression of hOAT1 at the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes, but decreased the transport of p-aminohippurate (PAH) considerably. Extracellular glutarate inhibited, and intracellular glutarate trans-stimulated, wild type and mutated OAT1, suggesting, for the mutant R466K, an unimpaired interaction with dicarboxylates. However, when R466 was replaced by the negatively charged aspartate (R466D), glutarate no longer interacted with the mutant. PAH uptake by wild type hOAT1 was strongly stimulated in the presence of chloride, whereas the R466K mutant was chloride-insensitive. Likewise, the uptake of labelled glutarate or ochratoxin A was chloride-dependent in the wild type, but not in the mutant R466K. Kinetic experiments revealed that chloride did not alter the apparent Km for PAH, but influenced Vmax in wild type OAT1-expressing oocytes. In R466K mutants, the apparent Km for PAH was similar to that of the wild type, but Vmax was changed. We conclude that R466 influences the binding of glutarate, but not interaction with PAH, and R466 interacts with chloride which is a major determinant in substrate movements through the transporter.
Keywords: organic anion transporter; mutagenesis; chloride
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Der organische-Anionen-Transporter 1 (OAT1) ist für
die renale Ausscheidung organischer Anionen von großer
Bedeutung. Dennoch ist gegenwärtig wenig über
Struktur-Wirkungsbeziehungen und über die Bindung und
Translokation von Substraten bekannt. In dieser Arbeit
wurden konservierte, positive geladene Aminosäurereste
des OAT1 untersucht, die etwas mit Substratbindung und
transport zu tun haben könnten. Außerdem wurden der
Einfluss des pH-Wertes und des Chlorids auf die
Transportaktivität des OAT1 sowie seine Wechselwirkung
mit Zitratzyklusderivaten untersucht. Die
Carboxyfluorescein-Aufnahme in HEK293-Zellen, die den
humanen OAT1 stabil exprimierten, wurde durch
alpha-Ketoglutarat > Succinat > Zitrat > Malat
im Medium gehemmt. Die Entfernung von Chlorid aus dem
Medium hemmte die Aktivität des OAT1 deutlich, während
eine Ansäuerung von pH 7,4 auf 6,0 den Transport von
radioaktiv markiertem p-Aminohippurat (PAH) und
Glutarat signifikant stimulierte. Durch gerichtete
Mutagenese wurden diverse geladene Aminosäurereste
ersetzt und die Mutanten funktionell charakterisiert.
Der Ersatz des Arginins an Position 446 in der 11.
Transmembrandomäne durch das ebenfalls positiv geladene
Lysin (R466K) führte zu einer starken Reduktion der
PAH-Aufnahme bei unveränderter Proteinexpression in der
Membran von Xenopus laevis Oozyten. Die PAH-Aufnahme
wurde durch extrazelluläres Glutarat gehemmt und durch
intrazelluläres Glutarat stimuliert, was auf eine
unveränderte Interaktion der R466K-Mutante mit
Dikarboxylaten hindeutet. Wenn aber das Arginin durch
das negativ geladene Aspartat (R466D) ausgetauscht
wurde, war die Wechselwirkung mit Glutarat aufgehoben.
Im Gegensatz zum Wildtyp-OAT1 wurde die PAH-Aufnahme
durch die R466K-Mutante nicht mehr durch Chlorid
stimuliert. Auch der Transport von markiertem Glutarat
und Ochratoxin war beim Wildtyp, nicht aber bei der
R466K-Mutante chloridabhängig. Untersuchungen zur
Transportkinetik ergaben, dass Chlorid beim Wildtyp-OA
T1 die Vmax erhöht, die Affinität (Km) aber
unbeeinflusst lässt. Die R466K-Mutante zeigte eine
reduzierte Vmax bei gegenüber dem Wildtyp unveränderter
Km für PAH. Wir schließen aus den Befunden, dass das
Arginin 466 mit Chlorid interagiert und für den
PAH-Translokationsschritt von Bedeutung ist.
Schlagwörter: Organische-Anionen-Transporter; Mutagenese; Chlorid
