Expression and functional analyses of murine Pelota (Pelo) gene
Expressions- und funktionelle Analyse des murinen Pelota (Pelo)-Gens
von Byambajav Buyandelger
Datum der mündl. Prüfung:2007-01-17
Erschienen:2007-04-25
Betreuer:Prof. Dr. Ibrahim Adham
Gutachter:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:PD Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Name:buyandelger.pdf
Size:2.36Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
In the present study, we have studied the expression pattern of Pelo at the protein level with the help of polyclonal anti-Pelo antibody and generation of conditional inactivation, which is based on the Cre/loxP recombination system to overcome early embryonic lethality. In order to study the expression of Pelo protein and determine the subcellular localisation of Pelo, we have generated polyclonal anti-Pelo antibody against Pelo-GST fusion protein. The immunocytochemical analysis revealed that Pelo is localised at the cytoskeleton, associating to the stress actin filaments. By Western blot analysis with protein from different cellular fractions of testis was confirmed that presence of Pelo in the cytoskeleton and membrane-fractions but not in nuclear and cytoplasmic fractions. These results suggest a possible role of Pelo in cytoskeleton organization and cell motility. Furthermore, Western blot results show that Pelo protein ubiquitously expressed in all adult tissues as well as during embryonic development. To circumvent early embryonic lethality of Pelo null mice, we generated targeting vector for the generation of Pelo conditional knockout mice using inducible Cre-LoxP recombination system. Mice heterozygous and homozygous for Pelo floxed alleles are viable and fertile. To achieve temporal inactivation of floxed Pelo allele in vivo, Cre-ERT fusion allele was introduced in the genome of Peloflox/- mice. Tamoxifen (TAM) treated Pelo∆/-CreERT mice are subfertile with decreasing fertility over time and multiple defects in spermatogenesis which show the affected fractions of seminiferous tubules having markedly reduced germ cells and containing significant vacuolization. Following Southern and Western blot analyses revealed that the Cre-mediated recombination occurred partially in vitro and in vivo. To investigate the effect of Pelo overexpression, two transgenic mice lines containing the human Pelo cDNA under the control of human elongation factor-1α and human ubiquitin (hUbC) promoter, respectively. The expression of Pelo transgene was restricted to the testis of pUB-Pelo transgenic line, whereas a high expression in all studied tissues as a testis, kidney and spleen of pEF-Pelo line. Taken together, the conditional knockout and transgenic mice lines are useful genetic tools for dissecting the functions of Pelo in spermatogenesis as well as postnatal development.
Keywords: Pelota gene; conditional knockout mice; transgenic mice; spermatogenesis;
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In der vorliegenden Studie wurde das
Expressionsmuster des Pelota Gens mit Hilfe eines
polyklonalen anti-Pelo Antikörpers auf Proteinebene
untersucht. Des weiteren wurde ein konditionelles
Knockout Konstrukt basierend auf einem Cre/Lox P
rekombinierten System erzeugt, um die frühe embryonale
Letalität homozygot defizienter Pelota knockout Mäuse
zu umgehen. Um die subzelluläre Lokalisation des Pelota
Proteins zu ermitteln, wurde ein polyklonaler anti-Pelo
Antikörper gegen das Pelo-GST-Fusionsprotein erzeugt.
Die immunzytochemische Analyse zeigt, dass Pelota am
Zytoskelett lokalisiert ist, wo es mit den
Stress-Aktin-Filamenten assoziiert ist. Western Blot
Analysen mit Protein aus verschiedenen zellulären
Fraktionen des Testis zeigen die Anwesenheit von Pelota
in der Zytoskelett- und der Membran-Fraktion. Hingegen
konnte Pelota nicht in der Zellkern- und der
Zytoplasma-Fraktion nachgewiesen werden. Diese
Resultate lassen vermuten, dass Pelota für den Aufbau
des Zytoskeletts und die Zellmigration essentiell ist.
Des weiteren zeigten die Ergebnisse der Western Blot
Analysen, dass das Pelota-Protein in allen Geweben
adulter Mäuse sowie während der Embryonalentwicklung
ubiquitinär exprimiert wird. Um die frühe embryonale
Letalität der Pelo-/- Mäuse zu umgehen, wurde eine
konditioneller Pelota Knock-Out unter Verwendung eines
Cre/LoxP Rekombinationssystems generiert. Die für das
Pelo-Flox Allel heterozygoten und homozygoten Tiere
sind lebensfähig und fertil. Um eine temporäre
Inaktivierung der Pelo-Flox Allele in vivo
sicherzustellen, wurde das Cre-ERT Fusionsallel in das
Genom der Peloflox/- Mäuse integriert. Tamoxifen (TAM)
behandelte PeloΔ/-Cre ERT Mäuse sind subfertil, mit
zunehmenden Alter der Tiere nimmt die Fertilität stark
ab. Zudem zeigen diese Mäuse multiple Defekte der
Spermatogenese, wie eine reduzierte Anzahl von
Keimzellen und eine signifikante Vakuolisierung in den
Seminiferi Tubuli. Weiterführende Southern- und Western
Blot Analysen zeigten, dass die Cre-Rekombination in
vitro als auch in vivo nur unvollständig auftritt. Um
die Folgen einer Pelota Überexpression zu untersuchen,
wurden zwei transgene Mauslinien erzeugt, die jeweils
die humane Pelo c-DNA unter Kontrolle des human
elongation factor-1a (pEF)- und des human ubiquitin
(hUbC)- Promotors exprimieren. Es konnte gezeigt
werden, dass in der pUB-Pelo transgenen Linie die
Expression des Pelo-Transgens auf die Testis beschränkt
ist, während in der pEF-Pelo Linie alle untersuchten
Organe, insbesondere Testis, Niere und Milz eine starke
Expression aufwiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen,
dass sowohl der konditionelle Knock-Out als auch die
Studie der transgenen Mauslinien wirkungsvolle Methoden
sind, um die Funktion von Pelota in der Spermatogenese
und der postnatalen Entwicklung zu analysieren.
Schlagwörter: Pelota Gen; konditionelle knockout mäuse; transgene mäuse; spermatogenese