Expression and functional analyses of murine Pelota (Pelo) gene

Abstract

In der vorliegenden Studie wurde das Expressionsmuster des Pelota Gens mit Hilfe eines polyklonalen anti-Pelo Antikörpers auf Proteinebene untersucht. Des weiteren wurde ein konditionelles Knockout Konstrukt basierend auf einem Cre/Lox P rekombinierten System erzeugt, um die frühe embryonale Letalität homozygot defizienter Pelota knockout Mäuse zu umgehen. Um die subzelluläre Lokalisation des Pelota Proteins zu ermitteln, wurde ein polyklonaler anti-Pelo Antikörper gegen das Pelo-GST-Fusionsprotein erzeugt. Die immunzytochemische Analyse zeigt, dass Pelota am Zytoskelett lokalisiert ist, wo es mit den Stress-Aktin-Filamenten assoziiert ist. Western Blot Analysen mit Protein aus verschiedenen zellulären Fraktionen des Testis zeigen die Anwesenheit von Pelota in der Zytoskelett- und der Membran-Fraktion. Hingegen konnte Pelota nicht in der Zellkern- und der Zytoplasma-Fraktion nachgewiesen werden. Diese Resultate lassen vermuten, dass Pelota für den Aufbau des Zytoskeletts und die Zellmigration essentiell ist. Des weiteren zeigten die Ergebnisse der Western Blot Analysen, dass das Pelota-Protein in allen Geweben adulter Mäuse sowie während der Embryonalentwicklung ubiquitinär exprimiert wird. Um die frühe embryonale Letalität der Pelo-/- Mäuse zu umgehen, wurde eine konditioneller Pelota Knock-Out unter Verwendung eines Cre/LoxP Rekombinationssystems generiert. Die für das Pelo-Flox Allel heterozygoten und homozygoten Tiere sind lebensfähig und fertil. Um eine temporäre Inaktivierung der Pelo-Flox Allele in vivo sicherzustellen, wurde das Cre-ERT Fusionsallel in das Genom der Peloflox/- Mäuse integriert. Tamoxifen (TAM) behandelte PeloΔ/-Cre ERT Mäuse sind subfertil, mit zunehmenden Alter der Tiere nimmt die Fertilität stark ab. Zudem zeigen diese Mäuse multiple Defekte der Spermatogenese, wie eine reduzierte Anzahl von Keimzellen und eine signifikante Vakuolisierung in den Seminiferi Tubuli. Weiterführende Southern- und Western Blot Analysen zeigten, dass die Cre-Rekombination in vitro als auch in vivo nur unvollständig auftritt. Um die Folgen einer Pelota Überexpression zu untersuchen, wurden zwei transgene Mauslinien erzeugt, die jeweils die humane Pelo c-DNA unter Kontrolle des human elongation factor-1a (pEF)- und des human ubiquitin (hUbC)- Promotors exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass in der pUB-Pelo transgenen Linie die Expression des Pelo-Transgens auf die Testis beschränkt ist, während in der pEF-Pelo Linie alle untersuchten Organe, insbesondere Testis, Niere und Milz eine starke Expression aufwiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl der konditionelle Knock-Out als auch die Studie der transgenen Mauslinien wirkungsvolle Methoden sind, um die Funktion von Pelota in der Spermatogenese und der postnatalen Entwicklung zu analysieren.