Expression and Functional Analysis of the Fas-Associated Factor1 (Faf1) Gene

Abstract

Expressionsanalyse und funktionelle Analyse des Fas-Associated Factor 1 (Faf1) Gens Schlüsselwörter: Faf1, VCP, UBA, UBX, TUNEL Dissertation zur Erlangung des Doktortitels, angenommen von: Georg-August-Universität Göttingen, Mathematisch-naturwissenschaftliche Fakultäten, 2006-02-05. Abstract In der vorliegenden Studie wurde das Expressionsmuster von Faf1 und die Entwicklung der gene trap Linie Faf1GT/GT untersucht. Expressionsanalysen zeigten, dass Faf1 in den meisten murinen Geweben und besonders stark im murinen Testis exprimiert wird. Western Blot Analysen zeigten ein 74kDA Protein in allen Geweben und ein testisspezifisches kleineres 49kDA Protein. Das Expressionsmuster von Faf1 während der Testisentwicklung zeigt eine starke Zunahme ab Tag 25. Auf Proteinebene konnte die 74kDa-Isoform während der gesamten Testisentwicklung nachgewiesen werden. Die 49kDA-Isoform konnte ab Tag 25 nachgewiesen werden, mit einer steigenden Expression in der nachfolgenden Entwicklung. Durch immunhistochemische Analysen konnte Faf1 im Zytoplasma von elongierten Spermatiden, nicht aber in reifen Spermien detektiert werden. Heterozygote gene trap Mäuse erscheinen normal, dennoch sind 15% der heterozygoten Männchen infertil. Alle seminiferi tubuli dieser Männchen zeigten eine reduzierte Anzahl von Spermien und eine Karyolyse der meisten primären Spermatocyten. Durch TUNEL Experimente konnte kein Anstieg von apoptotischen Zellen in Testis von heterozygoten Tieren nachgewiesen werden. Durch die Genotypisierung von Embryonen aus heterozygoten Verpaarungen, konnte der Entwicklungsstop von homozygoten Embryonen nach dem 2-Zell-Stadium nachgewiesen werden. Immunfluoreszenz-Färbungen konnten das Faf1 Protein in Oocyten im Ovar, in unbefruchteten Oocyten und in Präimplantations-Stadien der Embryonalentwicklung nachweisen. Im Embryo konnte durch RT-PCR eine Faf1-Expression ab dem 4-Zell-Stadium gezeigt werden. Morphologische Analysen von Embryonen früher Morula-Stadien deuten darauf hin, dass der Verlust von Faf1 zu starkem Zellsterben führt. TUNEL Experimente heterozygoter Verpaarungen zeigen, dass der Tod der Embryonen auf einem nicht apoptotischen Signalweg wie Necrose beruht. Faf1 wurde durch einen Yeast two hybrid assay identifiziert, in dem die cytoplasmische Domäne von FAS als Köder benutzt wurde. Im Gegensatz zu FAS besitzt Faf1 keine Death Domäne, aber zwei Ubiquitin homologe Domänen, UBA und UBX. Um die interagierenden Proteine, welche die UBX Domäne binden, zu identifizieren, wurde ein GST-Pulldown Assay mit dem GST-UBX Fusionsprotein und Testis- und Gehirn-Proteinen durchgeführt. Wir konnten eine Interaktion mit einem 96kDA Protein, VCP, nachweisen, was durch peptide mass fingerprinting und Sequenzierung bestätigt werden konnte. Die Anwesenheit der UBA und UBX Domäne in der Primärstruktur von Faf1 deutet an, dass Faf1 die Proteindegradation in dem Ubiquitin-Proteasom-Signalweg reguliert. Das frühe Absterben der Faf1GT/GT Embryonen verhinderte die Analyse der Rolle von Faf1 in dem Ubiquitin-Proteasom-Signalweg. Deshalb könnte die Herstellung einer konditionellen Knockout Maus eine geeignete Methode sein, um die Funktion von Faf1 während der Embryonalentwicklung und der Spermatogenese zu untersuchen. Betreuer: Adham, Ibrahim Prof. Dr. Gutachter: Engel, Wolfgang Prof. Dr.