Role of palmitoylation in the serotonin receptor functioning

Abstract

Wir untersuchten die Wirkung von Palmitoylierungen der 5-HT1A und 5-HT4(a) Rezeptoren auf die Funktion von Rezeptoren. Im Fall von 5-HT4(a) Rezeptoren konnten wir darlegen, dass Palmitoylierung des Rezeptors die Phosphorylierung beeinflusst. Wir zeigten, dass der 5-HT4(a) Rezeptor nach 5-HT Stimulation schnelle (t½=2 min) und dosisabhängige (EC50=180 nM) Phosphorylierungen an den Serinresten mit Hilfe einer Staurosporin-insensitiven Rezeptorkinase durchmacht. Die acylierungsdefiziente (Cys328/29 Ser) Mutante, die in Abwesenheit eines Liganden konstitutiv aktiv ist, zeigte eine verstärkte Rezeptorphoshorylierung unter basal- sowie Agonist stimulierten Bedingungen und war durch den GRK2/b-Arrestin Pfad wirksamer desensitisiert und internalisiert im Vergleich zum Wildtyp des 5-HT4(a) Rezeptors. Die G-Protein Aktivierung, die Phosphorylierung, die Desensitisierung und die Internalisierung der anderen acylierungsdefizienten Rezeptormutanten waren unterschiedlich betroffen! . Die Analyse der dynamischen Interaktion zwischen dem Rezeptor und b-Arrestin2 mit Hilfe des BRET2 Assays ergab, dass Wildtyp und alle palmitoylierungsdefizienten Mutanten nach Stimulation mit dem Agonisten eine beschleunigte Interaktion mit b-Arrestin2 aufwiesen. Die acylierungsdefizienten Mutanten zeigten eine höheres basales Interaktionslevel mit b-Arrestin2 als der Wildtyp aber eine geringere Interaktionskinetik (t½=12 sec. für Cys328/29 S vs. 10 Sekunden für den Wildtyp) nach Stimulation durch den Agonisten. Koexpression der Wildtypform von GRK2 begünstigt die Rezeptor-b-Arrestin2 Interaktion, während die dominant negative Mutante diesen Effekt etwas reduziert, was darauf hindeutet, dass der positive Effekt von GRK auf die Rezeptor-b-Arrestin2 Interaktion durch die enzymatische Aktivität sowie durch die direkte Interaktion von GRK mit dem Rezeptor vermittelt wird. Diese Ergebnisse lassen darauf schliessen, dass die Palmitoylierung eine wichtige Rolle bei der Modulati! on der 5-HT4(a) Rezeptorfunktion spielt und das G-Protein Aktivierung, Phosphorylierung, Desensitisierung und Internalisierung der Rezeptorfunktion durch diese dynamischen Modifizierungen reguliert werden. Im zweiten Teil dieser Studie befassten wir uns mit der Frage des molekularen Mechanismus, wie die Rezeptorpalmitoylierung die Kommunikation zwischen Rezeptoren und Gai-Proteinen reguliert. Im Gegensatz zum 5-HT4(a) Rezeptor, bei dem eine dynamische Palmitoylierung stattfindet, ist die Palmitoylierung des 5-HT1A Rezeptors eine irreversible Modifikation. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung des 5-HT1A Rezeptors zu einer Aktivierung des Gαi3 Proteins führen. Im Gegensatz dazu konnte bei der acylierungsdefizienten 5-HT1A Mutante die Aktivierung von Gαi3 nach Agonist Stimulation nicht beobachtet werden. Durch die Anwendung von Gradientenzentrifugation und Co-Pattching Assays konnten wir zeigen, dass sich eine signifikante Fraktion des 5-HT1A Rezeptors in den Lipid Rafts befindet, währenddessen der Gehalt an palmitoylierungsdefizienten Rezeptoren in diesen Mikrodomänen beträchtlich reduziert ist. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Rezeptorpalmitoylierung als Zielsignal für die Beibehaltung der 5-HT1A Rezeptoren in den Lipid Rafts dient und das die Raftlokalisation der 5-HT1A Rezeptoren in den Rezeptor-vermittelten Signalweg eingebunden ist.