Development of an orthogonal ligand-receptor pair based on synthetic estrogen analogs and engineered estrogen receptor for transcriptional regulation

Entwicklung eines orthogonalen Liganden-Rezeptor-Paares auf der Basis von synthetischen Östrogen-Analoga und einem manipulierten Östrogen-Rezeptor zur transkriptionellen Regulation

by Kazi Mohammed Didarul Islam
Doctoral thesis
Date of Examination:2007-05-03
Date of issue:2007-05-29
Advisor:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Dröge-Laser
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1308

 

 

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Description:Dissertation

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Abstract

English

The aim of this dissertation was the development of an inducible gene switch based on a modified human estrogen receptor and non-steroidal estradiol analogs. To that end, an in vivo test system in yeast has been used that allowed assessment of the transactivation properties of the artificial ligands in WT and mutated receptors. Using a systematic directed evolution approach based on identification of ligand contacting residues, saturation and finally random mutagenesis, a triple mutant (L384F L387M Y537S) was identified which showed altered induction kinetics with ligand CV3320. The mutant was 10-fold less active with natural ligand E2 whereas showed 160-fold increased activity with CV3320, leading to a 1.6x103 fold improvement. When the three exchanges were tested separately, the mutations were found non-additive but synergistic. In the WT-receptor only E2 is active but not the ligand CV3320. In the triple mutant the activity of E2 was dramatically decreased whereas the ligand CV3320 showed a significant increase in transactivation properties, thus creating a true orthogonal ligand-receptor combination.
Keywords: estrogen receptor; gene switch; directed evolution

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Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines induzierbaren Genschalters der auf einem modifizierten Östrogenrezeptor und nicht-steroidalen Östradiol-Analoga beruht. Hierzu wurde ein in vivo Testsystem in Hefe verwendet, welches es erlaubte die Transaktivierungseigenschaften der künstlichen Liganden im Wildtyp-Rezeptor und den mutierten Rezeptoren sowohl qualitativ als auch quantitativ zu bewerten. Durch eine systematische Methode basierend auf gerichteter Evolution der Liganden-bindenen Aminosäuren des Rezeptors sowie Sättigungs- und später Zufallsmutagenese wurde eine Dreifach-Mutante (L384F L387M Y537S) identifiziert, welche eine veränderte Induktionskinetik mit dem Liganden CV3320 aufwies. Die Mutante zeigte eine 10-fach geringere Aktivität mit dem natürlichen Liganden Östradiol (E2), jedoch eine 160-fach erhöhte Aktivität mit CV3320, welches zusammen zu einer 1,6x103-fachen Verbesserung führte. Die Untersuchung der drei separierten Aminosäure-Austausche zeigte, dass die Mutationen nicht additiv wohl aber synergistisch zusammen wirken. Im Wildtyp-Rezeptor ist nur Östradiol aktiv jedoch nicht der Ligand CV3320. In der Dreifach-Mutante ist die Aktivität von Östradiol dramatisch reduziert, wohingegen der Ligand CV3320 signifikant gesteigerte Transaktivierungseigenschaften zeigt, was zur Ausbildung einer wirklichen orthogonalen Liganden-Rezeptor-Kombination führt.
Schlagwörter: Östrogen-Rezeptor; Genschalter; gerichtete Evolution
 
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