Development of an orthogonal ligand-receptor pair based on synthetic estrogen analogs and engineered estrogen receptor for transcriptional regulation

Abstract

Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines induzierbaren Genschalters der auf einem modifizierten Östrogenrezeptor und nicht-steroidalen Östradiol-Analoga beruht. Hierzu wurde ein in vivo Testsystem in Hefe verwendet, welches es erlaubte die Transaktivierungseigenschaften der künstlichen Liganden im Wildtyp-Rezeptor und den mutierten Rezeptoren sowohl qualitativ als auch quantitativ zu bewerten. Durch eine systematische Methode basierend auf gerichteter Evolution der Liganden-bindenen Aminosäuren des Rezeptors sowie Sättigungs- und später Zufallsmutagenese wurde eine Dreifach-Mutante (L384F L387M Y537S) identifiziert, welche eine veränderte Induktionskinetik mit dem Liganden CV3320 aufwies. Die Mutante zeigte eine 10-fach geringere Aktivität mit dem natürlichen Liganden Östradiol (E2), jedoch eine 160-fach erhöhte Aktivität mit CV3320, welches zusammen zu einer 1,6x103-fachen Verbesserung führte. Die Untersuchung der drei separierten Aminosäure-Austausche zeigte, dass die Mutationen nicht additiv wohl aber synergistisch zusammen wirken. Im Wildtyp-Rezeptor ist nur Östradiol aktiv jedoch nicht der Ligand CV3320. In der Dreifach-Mutante ist die Aktivität von Östradiol dramatisch reduziert, wohingegen der Ligand CV3320 signifikant gesteigerte Transaktivierungseigenschaften zeigt, was zur Ausbildung einer wirklichen orthogonalen Liganden-Rezeptor-Kombination führt.