Development of an orthogonal ligand-receptor pair based on synthetic estrogen analogs and engineered estrogen receptor for transcriptional regulation
Entwicklung eines orthogonalen Liganden-Rezeptor-Paares auf der Basis von synthetischen Östrogen-Analoga und einem manipulierten Östrogen-Rezeptor zur transkriptionellen Regulation
by Kazi Mohammed Didarul Islam
Date of Examination:2007-05-03
Date of issue:2007-05-29
Advisor:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Dröge-Laser
Files in this item
Name:islam.pdf
Size:2.57Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The aim of this dissertation was the development of an inducible gene switch based on a modified human estrogen receptor and non-steroidal estradiol analogs. To that end, an in vivo test system in yeast has been used that allowed assessment of the transactivation properties of the artificial ligands in WT and mutated receptors. Using a systematic directed evolution approach based on identification of ligand contacting residues, saturation and finally random mutagenesis, a triple mutant (L384F L387M Y537S) was identified which showed altered induction kinetics with ligand CV3320. The mutant was 10-fold less active with natural ligand E2 whereas showed 160-fold increased activity with CV3320, leading to a 1.6x103 fold improvement. When the three exchanges were tested separately, the mutations were found non-additive but synergistic. In the WT-receptor only E2 is active but not the ligand CV3320. In the triple mutant the activity of E2 was dramatically decreased whereas the ligand CV3320 showed a significant increase in transactivation properties, thus creating a true orthogonal ligand-receptor combination.
Keywords: estrogen receptor; gene switch; directed evolution
Other Languages
Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines
induzierbaren Genschalters der auf einem modifizierten
Östrogenrezeptor und nicht-steroidalen
Östradiol-Analoga beruht. Hierzu wurde ein in
vivo Testsystem in Hefe verwendet, welches es
erlaubte die Transaktivierungseigenschaften der
künstlichen Liganden im Wildtyp-Rezeptor und den
mutierten Rezeptoren sowohl qualitativ als auch
quantitativ zu bewerten. Durch eine systematische
Methode basierend auf gerichteter Evolution der
Liganden-bindenen Aminosäuren des Rezeptors sowie
Sättigungs- und später Zufallsmutagenese wurde eine
Dreifach-Mutante (L384F L387M Y537S) identifiziert,
welche eine veränderte Induktionskinetik mit dem
Liganden CV3320 aufwies. Die Mutante zeigte eine
10-fach geringere Aktivität mit dem natürlichen
Liganden Östradiol (E2), jedoch eine 160-fach erhöhte
Aktivität mit CV3320, welches zusammen zu einer
1,6x103-fachen Verbesserung führte. Die
Untersuchung der drei separierten Aminosäure-Austausche
zeigte, dass die Mutationen nicht additiv wohl aber
synergistisch zusammen wirken. Im Wildtyp-Rezeptor ist
nur Östradiol aktiv jedoch nicht der Ligand CV3320. In
der Dreifach-Mutante ist die Aktivität von Östradiol
dramatisch reduziert, wohingegen der Ligand CV3320
signifikant gesteigerte Transaktivierungseigenschaften
zeigt, was zur Ausbildung einer wirklichen orthogonalen
Liganden-Rezeptor-Kombination führt.
Schlagwörter: Östrogen-Rezeptor; Genschalter; gerichtete Evolution