dc.contributor.advisor | Lührmann, Reinhard Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Karaduman, Ramazan | de |
dc.date.accessioned | 2012-05-16T12:09:15Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:50:41Z | de |
dc.date.issued | 2007-08-09 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B628-9 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1310 | |
dc.description.abstract | Die U6 small nuclear RNA (snRNA) durchläuft im
Verlauf des prä-mRNA Spleißens und des
Spliceosome-assembly wichtige katalytische
Konformationsänderungen. Sie assoziiert mit dem
spezifischen Protein Prp24, und einem Proteinkomplex
bestehend aus sieben LSm Proteinen, welche dann das U6
small nuclear ribonucleoprotein (U6 snRNP) formen.
Diese Proteine wurden als RNA chaperones beschrieben,
welche die Bindung der U6 snRNA mit U4 snRNA
stimulieren. Sowohl der genaue Mechanismus, wie das
Prp24 Protein und der LSm-Komplex die U4/U6 Verbindung
fördern, als auch die Bindestellen des Prp24 Proteins
in dem U6 snRNP sind jedoch nicht bekannt. Um die
Bindestellen des Prp24 Proteins und der LSm Proteine an
der U6 snRNA, sowie den Mechanismus der U4/U6
Assoziation zu verstehen, wurden die aufgereinigten
nativen U6 snRNP Partikel mit chemical structure
probing, UV-crosslinking und hydroxyl radical
footprinting charakterisiert. Die drei Methoden weisen
nach, dass die nackte U6 snRNA eine sehr kompakte
Struktur hat, in Anwesenheit des Prp24 Proteins und der
LSm Proteine die RNA des U6 Partikels aber eine weitaus
offenere Struktur aufweist. Dies gilt offenbar
besonders für den 3 -Stem Loop und für den großen
assymetrischen internen Loop der U6 snRNA. In dieser
Anordnung werden mehrere Nukleotide im U6 snRNP für
Modifikation leicht zugänglich, welche in der nackten
U6 RNA nicht modifiziert werden. Das Prp24 Protein hat
eine starke Bindungsstelle an dem großen Loop
(Nukleotide 40-60) und eine schwächere an dem 3 -Stem
Loop im U6 snRNP. Eine Bindungsstelle für die
LSm-Proteine im U6 snRNP konnte jedoch nicht bestimmt
werden. Interessant ist, dass in Abwesenheit der
LSm-Proteine der 3 -Stem Loop der U6 snRNA mit dem
Prp24 Protein stärker gebunden ist. In der Anwesenheit
des Prp24 Proteins und der LSm Proteine, nimmt der
3 -Stem Loop eine geöffnete Konformation an. Wir gehen
von der Annahme aus, dass die Prp24 Protein-Bindung an
der U6 snRNA die Watson-Crick Basenpaarungs-Stellen
des assymetrischen Loops mit der U4 snRNA exponieren
könnte. Zusätzlich kann man anmerken, dass die Bildung
von Stem I und II des U4/U6 Duplexes durch die
Kooperation der LSm Proteine mit dem Prp24 Protein
vermittelt werden kann. Wir nehmen an, dass die
geöffnete Struktur der Hefe U6 snRNA in nativen U6
Partikeln auch auf die beiden humanen snRNAs U6 und
U6atac übertragen werden kann. Es konnte eine
chaperonartige Aktivität der LSm Proteine bei der
Bindung der U4 snRNA an U6 snRNA gezeigt werden. Wie
die LSm Proteine mit dem Prp24 Protein im U6 snRNP
interagieren, als auch wie der LSm-Komplex die U4/U6
Verbindung fördert ist jedoch nicht bekannt. Um zu
verstehen, wie das Prp24 Protein und der LSm-Komplex
räumlich organisiert sind, wurden hochreine U6 partikel
mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Je nachdem ob
die U6 Partikel chemisch fixiert sind oder nicht, zeigt
das U6 snRNP im Elektronenmikroskop zwei
unterschiedliche Konfigurationen: (1) eine geöffnete
oder (2) eine kompakte Form. Die geöffnete Form hat
eine langgestreckte Gestalt mit zwei deutlichen
Substrukturen. Eine Domäne besitzt eine eher runde
Form, während die andere kantig und eckig aussieht. Mit
einem zentralen Kontrastmittel-Fleck zeigt die runde
Substruktur das typische Erscheinungsbild des
ringförmigen LSm-Komplexes. Die zweite Domäne enthält
den großen Proteinbestandteil des U6 snRNPs, das Prp24
Protein. Die fixierten U6 snRNPs erscheinen wesentlich
kompakter. Die zwei Substrukturen, des LSm-Rings und
die Prp24 Protein-Domäne, sind nun kaum noch als
getrennte Domänen zu erkennen. Die kompakte Struktur
kann die Wechselwirkung zwischen das Prp24 Protein und
den LSm-Proteinen bewerkstelligen, wie auch die im
Two-Hybrid-Assay beobachteten Interaktionen zwischen
Prp24 Protein und den LSm-Proteinen vermuten lassen.
Obwohl die geöffnete Form des U6 snRNPs keine zufrieden
stellende Detailwiedergabe ermöglichte, enthalten die
fixierten U6 snRNPs gut definierte Klassensummen. Die
kompakte Form des U6 snRNPs könnte die authentische
Struktur sein, da die fixierten U6 Partikel eine
relativ einheitliche 3D Struktur aufweisen. Um
Informationen über Position der LSm-Proteine im Ring
und im besonderen über Nähe zur Prp24 Protein-Domäne zu
erfahren, wurden LSm-Proteine mit dem yECitrine-Protein
markiert. Die Markierungsexperimente zeigten, dass die
LSm4, -5, -6, -7, -8 Proteine deutlich entfernt von der
Stelle des LSm-Rings, von der die Prp24 Protein-Domäne
entspringt, liegen. Diese Experimente zeigten auch,
dass die LSm2 und LSm3 Proteine wahrscheinlich nahe der
Prp24 Protein-Bindungsstelle lokalisiert sind. Unsere
UV-Crosslinking Experimente zeigten, dass das Prp24
Protein und das LSm2 Protein zu nahe
beieinanderliegenden Nukleotiden UV quervernetzt werden
können. Dies deutet drauf hin, dass das LSm2 protein,
eventuell auch das LSm3 Protein, im LSm-Ring näher zur
Prp24 Protein-Bindungsstelle positionert ist als die
anderen LSm-Proteine. Die Markierungsexperimente
bestätigten auch, dass die hauptsächlich aus
Interaktionsdaten abgeleitete LSm-Protein-Abfolge
2-3-6-5-7-4-8 auch tatsächlich im LSm-Ring des U6
snRNPs so vorliegt. Unsere elektronenmikroskopische
Analyse des unfixierten und fixierten U6 snRNPs lassen
uns vermuten, dass die zwei Konfigurationen der
geöffneten oder der kompakten Form des U6 snRNPs
möglicherweise funktionell relevant sind. Der Wechsel
von kompakter Form zu offener Form könnte durch die
initiale Bindung der U4 snRNA veranlaßt sein, und so
die späten Schritte der U4 snRNA-Bindung
ermöglichen. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html | de |
dc.title | Determination of the Structure of the Spliceosomal U6 snRNP from Yeast, <i>Saccharomyces cerevisiae</i> | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Untersuchung der Struktur des spliceosomalen U6 snRNPs in der Hefe, <i>Saccharomyces cerevisiae</i> | de |
dc.contributor.referee | Ficner, Ralf Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2006-11-02 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften allgemein | de |
dc.description.abstracteng | The U6 small nuclear RNA (snRNA) undergoes major
conformational changes during the assembly of the
spliceosome and catalysis of splicing. It associates
with the specific protein Prp24p, and a set of seven
LSm2 8 proteins, to form the U6 small nuclear
ribonucleoprotein (snRNP). These proteins have been
proposed to act as RNA chaperones that stimulate
pairing of U6 with U4 snRNA to form the intermolecular
stem I and stem II of the U4/U6 duplex, whose formation
is essential for spliceosomal function. However, the
mechanism whereby Prp24p and the LSm complex
facilitates U4/U6 base-pairing, as well as the exact
binding site(s) of Prp24p in the native U6 snRNP, are
not well understood. In order to understand the binding
site(s) of Prp24 and LSm 2-8 proteins on the U6 snRNA,
as well as to shed light on the mechanism whereby
Prp24p and the LSm complex facilitate U4/U6 base
pairing, purified native U6 snRNPs were thoroughly
characterized by chemical structure probing, UV-cross
linking and hydroxyl radical footprinting. These three
methods demonstrate that the naked U6 snRNA structure
is very compact, whereas in the presence of Prp24p and
the LSm proteins, the RNA structure in the U6 particle
is much more open. This is particularly apparent for
the 3´-stem loop and a large internal asymmetrical loop
of the U6 snRNA, in which several nucleotides are
accessible to chemical modification in the U6 snRNP but
are inaccessible to such modification in the naked U6
snRNA. Prp24p binds strongly to the left-hand part of
the asymmetrical loop (nucleotides 40 60) and only
weakly to the 3´-stem loop in the U6 snRNP. On the
contrary, initially a binding of the LSm proteins in
the U6 snRNP could not be detected. Interestingly, the
3´-stem loop of the U6 snRNA is strongly contacted by
Prp24p when LSm proteins are missing, while, in the
presence of both Prp24p and LSm2p-8p the 3´-stem loop
assumes a more open conformation. Therefore, we suggest
that Prp24p presents the Watson-Crick base pairing
positions of the asymmetrical loop. In addition, in
cooperation with LSm proteins, Prp24p might be involved
in opening up the U6 RNA regions, whereby promoting the
formation of stems I and II of the U4/U6 duplex.
Interestingly, we find that the open structure of the
yeast U6 snRNA in native snRNPs can also be adopted by
human U6 and U6atac snRNAs. A chaperone-like activity
of LSm proteins was suggested during the U4/U6
annealing. However, how the LSm proteins interact with
Prp24p in U6 snRNPs and how the LSm2p-8p complex is
involved in U4 and U6 snRNA base pairing are still
unclear. To learn more about how Prp24p and LSm
proteins are spatially organised, we used electron
microscopy. Depending on whether U6 snRNP particles
were chemically fixed prior to electron microscopy
sample preparation or not, yeast U6 snRNPs show two
different structural configurations: (1) open or (2) a
compact close form. Electron microscopy analysis of U6
snRNPs with an open form shows a slightly elongated
shape with two distinct substructures. One substructure
has a round shape with an accumulation of stain in its
centre, which is typical for the LSm heptamer. The
second substructure consists of a bundle of smaller
domains and contains the other large protein mass of
the U6 snRNP, the Prp24p protein. The close form of U6
snRNPs exhibits a more compact structure. Moreover, the
two substructures in the close form are hardly
discernable probably because the Prp24p protein
overlaps the typical ring structure of the LSm
proteins. Indeed, such a conformation would allow more
interactions between Prp24p and LSm proteins as shown
previously by yeast two hybrid analysis. Although the
open form derived from unfixed U6 snRNPs shows
structural heterogeneity, single particle image
analysis revealed much more defined image classes with
the fixed particle. This closed form might reflect
indeed a biologically relevant state of U6 snRNP in
solution. The positions of various LSm proteins were
investigated by tagging with genetically introduced
yECitrine globular protein. These results showed that
the LSm4, -5, -6, -7, and -8 proteins are located at
well-defined positions in the LSm ring relative to the
Prp24p domain, while LSm2p and -3p are found near the
Prp24p domain. Indeed, our cross linking data showed
that the Prp24p and the LSm2 protein in the LSm complex
contact relatively close nucleotides at the base of the
U6 snRNA stem region. This further confirms that LSm2p,
eventually with LSm3p, are in close proximity to the
Prp24p domain. Our results also confirm the previously
proposed order of LSm proteins as 4-8-2-3-5-6-7 in the
LSm ring. Our data obtained by electron microscopy
analysis of unfixed or fixed U6 snRNP particles suggest
that different configurations of open and close forms
might have important functional implications. During
the transition from close to open form or vice versa,
U6 snRNA might undergo further structural
rearrangements, which would promote the annealing of
the stems I and II of U4/U6 duplex. | de |
dc.contributor.coReferee | Fritz, Hans-Joachim Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Computer Science | de |
dc.subject.ger | hefe U6 snRNP | de |
dc.subject.ger | hefe U6 snRNA | de |
dc.subject.ger | Prp24p | de |
dc.subject.ger | LSm Proteine | de |
dc.subject.ger | RNA Struktur Probing | de |
dc.subject.ger | Elektronenmikroskopie | de |
dc.subject.ger | YFP-Markierung | de |
dc.subject.eng | yeast U6 snRNP | de |
dc.subject.eng | yeast U6 snRNA | de |
dc.subject.eng | Prp24p | de |
dc.subject.eng | LSm2 8p proteins | de |
dc.subject.eng | RNA structure probing | de |
dc.subject.eng | electron microscopy | de |
dc.subject.eng | YFP labelling | de |
dc.subject.bk | 42.13 | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1550-3 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-1550 | de |
dc.affiliation.institute | Biologische Fakultät inkl. Psychologie | de |
dc.subject.gokfull | WF | de |
dc.identifier.ppn | 58718485X | de |