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Determination of the Structure of the Spliceosomal U6 snRNP from Yeast, Saccharomyces cerevisiae

dc.contributor.advisorLührmann, Reinhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorKaraduman, Ramazande
dc.date.accessioned2012-05-16T12:09:15Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:41Zde
dc.date.issued2007-08-09de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B628-9de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1310
dc.description.abstractDie U6 small nuclear RNA (snRNA) durchläuft im Verlauf des prä-mRNA Spleißens und des Spliceosome-assembly wichtige katalytische Konformationsänderungen. Sie assoziiert mit dem spezifischen Protein Prp24, und einem Proteinkomplex bestehend aus sieben LSm Proteinen, welche dann das U6 small nuclear ribonucleoprotein (U6 snRNP) formen. Diese Proteine wurden als RNA chaperones beschrieben, welche die Bindung der U6 snRNA mit U4 snRNA stimulieren. Sowohl der genaue Mechanismus, wie das Prp24 Protein und der LSm-Komplex die U4/U6 Verbindung fördern, als auch die Bindestellen des Prp24 Proteins in dem U6 snRNP sind jedoch nicht bekannt. Um die Bindestellen des Prp24 Proteins und der LSm Proteine an der U6 snRNA, sowie den Mechanismus der U4/U6 Assoziation zu verstehen, wurden die aufgereinigten nativen U6 snRNP Partikel mit chemical structure probing, UV-crosslinking und hydroxyl radical footprinting charakterisiert. Die drei Methoden weisen nach, dass die nackte U6 snRNA eine sehr kompakte Struktur hat, in Anwesenheit des Prp24 Proteins und der LSm Proteine die RNA des U6 Partikels aber eine weitaus offenere Struktur aufweist. Dies gilt offenbar besonders für den 3 -Stem Loop und für den großen assymetrischen internen Loop der U6 snRNA. In dieser Anordnung werden mehrere Nukleotide im U6 snRNP für Modifikation leicht zugänglich, welche in der nackten U6 RNA nicht modifiziert werden. Das Prp24 Protein hat eine starke Bindungsstelle an dem großen Loop (Nukleotide 40-60) und eine schwächere an dem 3 -Stem Loop im U6 snRNP. Eine Bindungsstelle für die LSm-Proteine im U6 snRNP konnte jedoch nicht bestimmt werden. Interessant ist, dass in Abwesenheit der LSm-Proteine der 3 -Stem Loop der U6 snRNA mit dem Prp24 Protein stärker gebunden ist. In der Anwesenheit des Prp24 Proteins und der LSm Proteine, nimmt der 3 -Stem Loop eine geöffnete Konformation an. Wir gehen von der Annahme aus, dass die Prp24 Protein-Bindung an der U6 snRNA die Watson-Crick Basenpaarungs-Stellen des assymetrischen Loops mit der U4 snRNA exponieren könnte. Zusätzlich kann man anmerken, dass die Bildung von Stem I und II des U4/U6 Duplexes durch die Kooperation der LSm Proteine mit dem Prp24 Protein vermittelt werden kann. Wir nehmen an, dass die geöffnete Struktur der Hefe U6 snRNA in nativen U6 Partikeln auch auf die beiden humanen snRNAs U6 und U6atac übertragen werden kann. Es konnte eine chaperonartige Aktivität der LSm Proteine bei der Bindung der U4 snRNA an U6 snRNA gezeigt werden. Wie die LSm Proteine mit dem Prp24 Protein im U6 snRNP interagieren, als auch wie der LSm-Komplex die U4/U6 Verbindung fördert ist jedoch nicht bekannt. Um zu verstehen, wie das Prp24 Protein und der LSm-Komplex räumlich organisiert sind, wurden hochreine U6 partikel mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Je nachdem ob die U6 Partikel chemisch fixiert sind oder nicht, zeigt das U6 snRNP im Elektronenmikroskop zwei unterschiedliche Konfigurationen: (1) eine geöffnete oder (2) eine kompakte Form. Die geöffnete Form hat eine langgestreckte Gestalt mit zwei deutlichen Substrukturen. Eine Domäne besitzt eine eher runde Form, während die andere kantig und eckig aussieht. Mit einem zentralen Kontrastmittel-Fleck zeigt die runde Substruktur das typische Erscheinungsbild des ringförmigen LSm-Komplexes. Die zweite Domäne enthält den großen Proteinbestandteil des U6 snRNPs, das Prp24 Protein. Die fixierten U6 snRNPs erscheinen wesentlich kompakter. Die zwei Substrukturen, des LSm-Rings und die Prp24 Protein-Domäne, sind nun kaum noch als getrennte Domänen zu erkennen. Die kompakte Struktur kann die Wechselwirkung zwischen das Prp24 Protein und den LSm-Proteinen bewerkstelligen, wie auch die im Two-Hybrid-Assay beobachteten Interaktionen zwischen Prp24 Protein und den LSm-Proteinen vermuten lassen. Obwohl die geöffnete Form des U6 snRNPs keine zufrieden stellende Detailwiedergabe ermöglichte, enthalten die fixierten U6 snRNPs gut definierte Klassensummen. Die kompakte Form des U6 snRNPs könnte die authentische Struktur sein, da die fixierten U6 Partikel eine relativ einheitliche 3D Struktur aufweisen. Um Informationen über Position der LSm-Proteine im Ring und im besonderen über Nähe zur Prp24 Protein-Domäne zu erfahren, wurden LSm-Proteine mit dem yECitrine-Protein markiert. Die Markierungsexperimente zeigten, dass die LSm4, -5, -6, -7, -8 Proteine deutlich entfernt von der Stelle des LSm-Rings, von der die Prp24 Protein-Domäne entspringt, liegen. Diese Experimente zeigten auch, dass die LSm2 und LSm3 Proteine wahrscheinlich nahe der Prp24 Protein-Bindungsstelle lokalisiert sind. Unsere UV-Crosslinking Experimente zeigten, dass das Prp24 Protein und das LSm2 Protein zu nahe beieinanderliegenden Nukleotiden UV quervernetzt werden können. Dies deutet drauf hin, dass das LSm2 protein, eventuell auch das LSm3 Protein, im LSm-Ring näher zur Prp24 Protein-Bindungsstelle positionert ist als die anderen LSm-Proteine. Die Markierungsexperimente bestätigten auch, dass die hauptsächlich aus Interaktionsdaten abgeleitete LSm-Protein-Abfolge 2-3-6-5-7-4-8 auch tatsächlich im LSm-Ring des U6 snRNPs so vorliegt. Unsere elektronenmikroskopische Analyse des unfixierten und fixierten U6 snRNPs lassen uns vermuten, dass die zwei Konfigurationen der geöffneten oder der kompakten Form des U6 snRNPs möglicherweise funktionell relevant sind. Der Wechsel von kompakter Form zu offener Form könnte durch die initiale Bindung der U4 snRNA veranlaßt sein, und so die späten Schritte der U4 snRNA-Bindung ermöglichen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleDetermination of the Structure of the Spliceosomal U6 snRNP from Yeast, <i>Saccharomyces cerevisiae</i>de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedUntersuchung der Struktur des spliceosomalen U6 snRNPs in der Hefe, <i>Saccharomyces cerevisiae</i>de
dc.contributor.refereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.date.examination2006-11-02de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaften allgemeinde
dc.description.abstractengThe U6 small nuclear RNA (snRNA) undergoes major conformational changes during the assembly of the spliceosome and catalysis of splicing. It associates with the specific protein Prp24p, and a set of seven LSm2 8 proteins, to form the U6 small nuclear ribonucleoprotein (snRNP). These proteins have been proposed to act as RNA chaperones that stimulate pairing of U6 with U4 snRNA to form the intermolecular stem I and stem II of the U4/U6 duplex, whose formation is essential for spliceosomal function. However, the mechanism whereby Prp24p and the LSm complex facilitates U4/U6 base-pairing, as well as the exact binding site(s) of Prp24p in the native U6 snRNP, are not well understood. In order to understand the binding site(s) of Prp24 and LSm 2-8 proteins on the U6 snRNA, as well as to shed light on the mechanism whereby Prp24p and the LSm complex facilitate U4/U6 base pairing, purified native U6 snRNPs were thoroughly characterized by chemical structure probing, UV-cross linking and hydroxyl radical footprinting. These three methods demonstrate that the naked U6 snRNA structure is very compact, whereas in the presence of Prp24p and the LSm proteins, the RNA structure in the U6 particle is much more open. This is particularly apparent for the 3´-stem loop and a large internal asymmetrical loop of the U6 snRNA, in which several nucleotides are accessible to chemical modification in the U6 snRNP but are inaccessible to such modification in the naked U6 snRNA. Prp24p binds strongly to the left-hand part of the asymmetrical loop (nucleotides 40 60) and only weakly to the 3´-stem loop in the U6 snRNP. On the contrary, initially a binding of the LSm proteins in the U6 snRNP could not be detected. Interestingly, the 3´-stem loop of the U6 snRNA is strongly contacted by Prp24p when LSm proteins are missing, while, in the presence of both Prp24p and LSm2p-8p the 3´-stem loop assumes a more open conformation. Therefore, we suggest that Prp24p presents the Watson-Crick base pairing positions of the asymmetrical loop. In addition, in cooperation with LSm proteins, Prp24p might be involved in opening up the U6 RNA regions, whereby promoting the formation of stems I and II of the U4/U6 duplex. Interestingly, we find that the open structure of the yeast U6 snRNA in native snRNPs can also be adopted by human U6 and U6atac snRNAs. A chaperone-like activity of LSm proteins was suggested during the U4/U6 annealing. However, how the LSm proteins interact with Prp24p in U6 snRNPs and how the LSm2p-8p complex is involved in U4 and U6 snRNA base pairing are still unclear. To learn more about how Prp24p and LSm proteins are spatially organised, we used electron microscopy. Depending on whether U6 snRNP particles were chemically fixed prior to electron microscopy sample preparation or not, yeast U6 snRNPs show two different structural configurations: (1) open or (2) a compact close form. Electron microscopy analysis of U6 snRNPs with an open form shows a slightly elongated shape with two distinct substructures. One substructure has a round shape with an accumulation of stain in its centre, which is typical for the LSm heptamer. The second substructure consists of a bundle of smaller domains and contains the other large protein mass of the U6 snRNP, the Prp24p protein. The close form of U6 snRNPs exhibits a more compact structure. Moreover, the two substructures in the close form are hardly discernable probably because the Prp24p protein overlaps the typical ring structure of the LSm proteins. Indeed, such a conformation would allow more interactions between Prp24p and LSm proteins as shown previously by yeast two hybrid analysis. Although the open form derived from unfixed U6 snRNPs shows structural heterogeneity, single particle image analysis revealed much more defined image classes with the fixed particle. This closed form might reflect indeed a biologically relevant state of U6 snRNP in solution. The positions of various LSm proteins were investigated by tagging with genetically introduced yECitrine globular protein. These results showed that the LSm4, -5, -6, -7, and -8 proteins are located at well-defined positions in the LSm ring relative to the Prp24p domain, while LSm2p and -3p are found near the Prp24p domain. Indeed, our cross linking data showed that the Prp24p and the LSm2 protein in the LSm complex contact relatively close nucleotides at the base of the U6 snRNA stem region. This further confirms that LSm2p, eventually with LSm3p, are in close proximity to the Prp24p domain. Our results also confirm the previously proposed order of LSm proteins as 4-8-2-3-5-6-7 in the LSm ring. Our data obtained by electron microscopy analysis of unfixed or fixed U6 snRNP particles suggest that different configurations of open and close forms might have important functional implications. During the transition from close to open form or vice versa, U6 snRNA might undergo further structural rearrangements, which would promote the annealing of the stems I and II of U4/U6 duplex.de
dc.contributor.coRefereeFritz, Hans-Joachim Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerhefe U6 snRNPde
dc.subject.gerhefe U6 snRNAde
dc.subject.gerPrp24pde
dc.subject.gerLSm Proteinede
dc.subject.gerRNA Struktur Probingde
dc.subject.gerElektronenmikroskopiede
dc.subject.gerYFP-Markierungde
dc.subject.engyeast U6 snRNPde
dc.subject.engyeast U6 snRNAde
dc.subject.engPrp24pde
dc.subject.engLSm2 8p proteinsde
dc.subject.engRNA structure probingde
dc.subject.engelectron microscopyde
dc.subject.engYFP labellingde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1550-3de
dc.identifier.purlwebdoc-1550de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWFde
dc.identifier.ppn58718485Xde


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