Nuclear transport of the DNA fragmentation factor via the classical importin α/β-pathway
Kerntransport des DNA-Fragmentierungsfaktors über den klassischen Importin α/β-Transportweg
Sonja Neimanis
Doctoral thesis
Date of Examination:
2007-05-04
Date of issue:
2007-11-02
Advisor:
Doenecke, Detlef Prof. Dr.
Referee:
Doenecke, Detlef Prof. Dr.
Referee:
Hardeland, Rüdiger Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B62B-3
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Size:
7,6 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
Abstract
English
One of the biochemical hallmarks of apoptosis is internucleosomal DNA fragmentation mediated by the endonuclease DNA fragmentation factor (DFF) 40. In proliferating cells DFF40 is expressed in the presence of its chaperone and inhibitor DFF45. The resulting DFF complex is translocated into the nucleus where DFF40 is activated during apoptosis due to cleavage of DFF45. Here, we report that the DFF complex is imported into the nucleus via the classical importin α/β-pathway. The sequence elements essential for recognition of the DFF complex by importin α/β were mapped to the C-terminal regions of both subunits. At least one basic cluster in each subunit, DFF40 (RLKRK) and DFF45 (KRAR), is required for nuclear import of the DFF complex. Moreover, the basic cluster KRAR was also identified as key element for the nuclear transport of monomeric DFF45. Further experiments strongly suggest that DFF45 exhibits a classical monopartite nuclear localization signal (NLS) that confers nuclear entry via the importin α/β-pathway. In addition, the C-terminal tail of DFF40 also harbors an independent NLS and activated DFF40 interacts not only with importin α/β but also with importin β. However, nuclear transport of DFF40 and therefore a functional relevance of these interactions could not be demonstrated. The fact that both DFF subunits contain NLSs suggests that these signals confer nuclear import of the DFF complex through independent interactions with importin α/β. Nevertheless, the interaction between importin α/β and the DFF complex was much stronger than binding of importin α/β to monomeric DFF45 or active DFF40, respectively. Furthermore, importin α/β-binding to the DFF complex was almost completely abolished when the C-terminal tail of either DFF40 or DFF45 was deleted. This indicates a substantial importin α/β-binding cooperativity that points to a binding model according to which DFF40 and DFF45 simultaneously interact with one importin α/β-heterodimer. Further results suggest that this interaction is mediated by a bipartite cNLS. Based on these data, we propose that the essential basic clusters in DFF40 (RLKRK) and DFF45 (KRAR) form an intermolecular bipartite cNLS recognized by importin α/β.
Keywords: DNA fragmentation factor; DFF; nucleocytoplasmic transport; importin α; importin β; nuclear localization signal
Other Languages
Zu den biochemischen Kennzeichen der Apoptose gehört
die internukleosomale DNA-Fragmentierung, die durch den
DNA-Fragmentierungsfaktor (DFF) 40 vermittelt wird. In
proliferierenden Zellen wird DFF40 in Gegenwart von
DFF45 exprimiert, das eine doppelte Funktion als
Chaperon und Inhibitor von DFF40 erfüllt. Der
entstehende DFF-Komplex wird in den Zellkern
transportiert, wo DFF40 im Verlauf der Apoptose durch
Spaltung von DFF45 aktiviert wird. In dieser Arbeit
wird gezeigt, dass der DFF-Komplex über den klassischen
Importin α/β-Transportweg in den Zellkern gelangt. Die
C-terminalen Bereiche beider Untereinheiten sind für
die Erkennung des DFF-Komplexes durch Importin α/β
essentiell. Wenigstens je eine Gruppe basischer
Aminosäuren in DFF40 (RLKRK) und DFF45 (KRAR) wird für
den Transport des DFF-Komplexes in den Zellkern
benötigt. Der basische Bereich KRAR ist darüber hinaus
das entscheidende Element für den Kernimport des
DFF45-Monomers. Weitere Experimente weisen daraufhin,
dass DFF45 ein klassisches monopartites
Kernlokalisationssignal (NLS) besitzt, das den Import
in den Zellkern über den Importin α/β-Transportweg
vermittelt. Außerdem enthält auch der C-Terminus von
DFF40 ein unabhängiges NLS und aktiviertes DFF40
interagiert nicht nur mit Importin α/β sondern auch mit
Importin β. Allerdings konnte der Transport von DFF40
und damit die Funktionalität dieser Interaktion nicht
nachgewiesen werden. Die Tatsache, dass beide
DFF-Untereinheiten NLSs enthalten spricht dafür, dass
diese Signale durch unabhängige Bindung an Importin α/β
den Kernimport des DFF-Komplexes bewirken. Die
Interaktion zwischen Importin α/β und dem DFF-Komplex
war jedoch deutlich stärker als die Bindung von
Importin α/β an das DFF45-Monomer oder aktives DFF40.
Weiterhin war die Importin α/β-Bindung an den
DFF-Komplex stark verringert, wenn entweder der
C-Terminus von DFF40 oder von DFF45 deletiert war.
Diese Ergebnisse weisen auf eine Kooperativität bei der
Bindung von Importin α/β hin, die durch simultane
Interaktion von DFF40 und DFF45 an ein Importin
α/β-Heterodimer erklärt werden kann. Weitere Ergebnisse
lassen vermuten, dass diese Interaktion durch ein
klassisches bipartites NLS vermittelt wird. Aufgrund
der präsentierten Daten schlagen wir ein
Interaktionsmodell vor, wonach die essentiellen
basischen Bereiche in DFF40 (RLKRK) und DFF45 (KRAR)
ein intermolekulares bipartites NLS bilden, das von
Importin α/β erkannt wird.
Schlagwörter: DNA-Fragmentierungsfaktor; DFF; nukleozytoplasmatischer Transport; Importin α; Importin β; Kernlokalisationssignal
