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Role of transport systems in cortisol release from human adrenal cells

dc.contributor.advisorMüller, Gerhard Anton Prof. Dr.de
dc.contributor.advisorBurckhardt, Gerhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorAsif, Abdul Rahmande
dc.date.accessioned2012-05-16T12:09:22Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:50Zde
dc.date.issued2004-05-25de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B62E-Ede
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1315
dc.description.abstractAdrenalen Steroidhormonen (z.B. Cortisol) fällt eine zentrale Schlüsselstellung in der Regulation und Erhaltung der metabolischen Homeostase zu. Die Sekretion der Glucokortikoide durch die adrenokortikalen Zellen in das Blut ist kaum erforscht. Basierend auf der lipophilen Struktur der Steroidhormone wurde lange Zeit postuliert, das die Sekretion durch einfache Diffusion vonstatten geht. Vor kurzem konnte jedoch gezeigt werden, das die Freigabe von Cortisol aus - sowie die Aufnahme von radioaktiv markiertem PAH in - adrenokortikale Zellen des Rindes ähnliche physiologische Charakteristik wie der renale organische Anionentauscher OAT1 zeigen. In dieser Arbeit sollte daher der Frage nachgegangen werden, ob der organische Anionentransporter OAT1 möglicherweise an der Cortisolsekretion durch die humane Nebennieren- Zelllinie NCI-H295R beteiligt ist. Die basale Cortisolsekretion über 24h konnte durch die Vorbehandlung mit ACTH um das dreifache gesteigert werden, durch Vorhandlung mit Forskolin sogar um den Faktor 30. Eine Inkubation mit PAH über 24h inhibierte teilweise die Cortisol Abgabe, wohingegen eine Hemmung der Sekretion durch Cimetidine relativ ausgeprägt nachgewiesen werden konnte, was auf Unterschiede zwischen NCI-H295R Zellen und den Zellen der Nebenniere des Rindes hindeutet. Mittels RT-PCR konnte keine Expression von humanem OAT1 und OAT2 sowohl in NCI-H295R als auch in normalem humanen Nebennierengewebe nachgewiesen werden, für OAT3 und OAT4 konnte jedoch mRNA detektiert werden. In Studien mit HEK-293 Zellen, die stabil mit humanem OAT1, OAT3 und OAT4 transfiziert wurden, zeigte sich eine schwächere Interaktion von Cortisol mit hOAT1 und hOAT4 als mit hOAT3. Werden humanes OAT1, OAT3 und OAT4 in Xenopus laevis Oozyten exprimiert, so zeigt (verglichen mit nicht exprimierenden Kontroll-Oozyten) nur hOAT3 eine Aufnahme von radioaktiv markiertem Cortisol.Die Cortisolaufnahme konnte mittels eines Kt Wertes von 2.5 µM gesättigt werden. Die Aufnahme von radioaktiv markiertem Östronsulfat (rl-Östronsulfat.) wurde durch unmarkiertes Cortisol mit einer IC50 von 15.6 µM inhibiert. Die Experimente mit NCI-H295R Zellen zeigten eine Sättigung der Aufnahme von rl-Östronsulfat, einem wichtigen Subtrat von hOAT3 (Ki=9.8µM). Die Inhibition mittels unmarkiertem DHEAS und Cortisol war durch IC50 Werte von 10.6µM (DHEAS) und 38.9µM (Cortisol) möglich. Eine Reduktion der Aufnahme von rl-Östronsulfat in NCI-H295R-Zellen konnte durch potente Inhibitoren von hOAT3, z.B. Probenecid, Cimetidin und Glutarat gezeigt werden. In NCI-H295R- Zellen konnte durch vorheriges Beladen mit Glutarat oder Cortisol eine Stimulation der Aufnahme von rl-Östronsulfat erzielt werden. Ähnliche Beobachtungen der Stimulation für die Aufnahme von PAH wurden durch vorheriges Beladen mit PAH, Gluratat oder Cortisol gemacht. In NCI-H295R Zellen konnte eine Aufnahme von rl-Östronsulfat und PAH signifikant gesteigert werden, indem die Zellen über einen Zeitraum von 24h mit Forskolin inkubiert wurden. Über semiquantitative RT-PCR wurde eine gesteigerte hOAT3 mRNA Expression nach Inkubation mit Forskolin gezeigt. Ebenso resultierte eine Inkubation mit Forskolin in einer signifikant erhöhten mRNA Expression der Enzyme der Steroid-Biosynthese (z.B. StAR, CYP17, 3ßHSD und CYP21A2). Mittels Immunfluoreszenz wurde über einen spezifischen hOAT3 Antikörper die Expression auf NCI-H295R Zellen bestätigt. Diese Expression war durch eine 24h Behandlung mit Forskolin steigerbar.Zusammenfassend lassen diese Daten vermuten das hOAT3 funktionell in NCI-H295R Zellen exprimiert wird und den Cortisol-Anionen Austausch ermöglicht. Neben anderen Mechanismen ist nach den in dieser Arbeit durchgeführten Analysen eine Beteiligung von OAT3 an der Sekretion von Cortisol aus humanen Nebennierenzellen wahrscheinlich.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleRole of transport systems in cortisol release from human adrenal cellsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedRolle der Transportsysteme in der Cortisolsekretion von den menschlichen adrenalen Zellende
dc.contributor.refereeHardeland, Rüdiger Prof. Dr.de
dc.date.examination2004-04-27de
dc.description.abstractengAdrenal steroid hormones (e.g., cortisol) play a pivotal role in the regulation and maintenance of metabolic homeostasis. The secretion of glucocorticoids from adrenocortical cells into the blood is poorly understood. It has long been postulated that this occurs via simple diffusion, based on the lipophilic structure of steroid hormones. Previously, it has been demonstrated that cortisol release from and uptake of radiolabeled PAH into bovine adrenocortical cells showed physiological characteristics similar to the renal/organic anion exchanger OAT1. In this study we investigated whether an organic anion transporter (OAT) may play a role in cortisol release from the human adrenal cell line, NCI-H295R. Basal 24 h cortisol secretion increased up to threefold by pretreatment with ACTH, and up to thirtyfold with forskolin. Incubation for 24 h with PAH partially inhibited cortisol release, while cimetidine inhibition was relatively pronounced, indicating some differences between NCI-H295R cells and bovine adrenal cells. RT-PCR did not reveal an expression of human OAT1 and OAT2, but OAT3 and OAT4 mRNA was detected in NCI-H295R cells as well as in normal human adrenal tissue. The studies with HEK-293 cells stably transfected with human OAT1, OAT3, and OAT4 showed a low interaction of cortisol with hOAT1 and hOAT4 as compared to hOAT3. When human OAT1, OAT3, and OAT4 were expressed in Xenopus laevis oocytes, only hOAT3 showed radiolabeled cortisol uptake beyond non-expressing control oocytes. Cortisol uptake was saturable with an apparent Kt value of 2.4 µM, and radiolabeled estrone sulfate uptake was inhibited by unlabeled cortisol with an IC50 of 15.6 µM. The experiments in NCI-H295R cells showed a saturable radiolabeled estrone sulfate uptake, a potent substrate of hOAT3, with a Ki value of 9.8 µM. The inhibition with unlabeled DHEAS and cortisol resulted in IC50 values of 10.6 and 38.9 µM, respectively. The radiolabeled estrone sulfate uptake in NCI-H295R cells was decreased by potent inhibitors of hOAT3, i.e. probenecid, cimetidine, and glutarate. In NCI-H295R cells, radiolabeled estrone sulfate uptake was trans-stimulated by preloading with glutarate or cortisol. Likewise, radiolabeled PAH uptake was trans-stimulated by preloading the cells with PAH, glutarate, or cortisol. The 24 h forskolin treatment significantly increased radiolabeled estrone sulfate and PAH uptake in NCI-H295R cells. Semi-quantitative RT-PCR showed an increased hOAT3 mRNA expression after pretreatment with forskolin. Forskolin-treatment induced a significant increase in the enzymes of steroids biosynthesis, i.e. StAR, CYP17, 3âHSD, and CYP21A2. Immunolocalization studies for hOAT3 resulted in expression of hOAT3 in NCI-H295R cells. There was a high increase in OAT3 expression by a 24 h treatment with forskolin. Our data suggests that OAT3 is functionally expressed in NCI-H295R cells and is able to perform cortisol/anion exchange. Thereby, OAT3 may - among other release mechanisms - contribute to cortisol efflux from human adrenal cells.de
dc.contributor.coRefereeGradmann, Dietrich Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeBurckhardt, Gerhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.ger500 Naturwissenschaften allgemeinde
dc.subject.gerCortisolde
dc.subject.gerOATde
dc.subject.gerOATPde
dc.subject.gerMDR1de
dc.subject.gerPgpde
dc.subject.gerGlukocorticoidde
dc.subject.gersteroide hormonede
dc.subject.engAdrenalde
dc.subject.engCortisolde
dc.subject.engOATde
dc.subject.engOATPde
dc.subject.engMDR1de
dc.subject.engPgpde
dc.subject.engGlucocorticoidsde
dc.subject.engsteroid hormonede
dc.subject.bk42.18de
dc.subject.bk42.17de
dc.subject.bk42.00de
dc.subject.bk44.89de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-163-1de
dc.identifier.purlwebdoc-163de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWA 000: Biologiede
dc.subject.gokfullWF 000: Molekularbiologie, Gentechnologiede
dc.subject.gokfullMED 419: Endokrinologiede
dc.identifier.ppn390103926de


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