Identification and Functional Characterization of Trans-acting Factors Involved in Vegetal mRNA Localization in Xenopus Oocytes
Mechanism of mRNA Localization in Xenopus Oocytes
Identifizierung und Funktionelle Charakterisierung Trans-agierender mRNA-Lokalisationsfaktoren in Xenopus Oozyten
Mechanismus der mRNA Lokalisation in Xenopus Oozyten
von Patrick Kobina Arthur
Datum der mündl. Prüfung:2008-06-27
Erschienen:2008-07-24
Betreuer:Prof. Dr. Tomas Pieler
Gutachter:Prof. Dr. Tomas Pieler
Gutachter:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Directional transport of specific mRNAs is a mechanism for the generation of asymmetry which is of primary biological importance. In Xenopus oocytes, mRNA localization to the vegetal cortex is important for germ layer formation and germ cell development. Using a biochemical purification approach for enriching localizing RNPs based on their large size, Xenopus Elr-type proteins which are in 4 isoforms, homologs of the Hu/ELAV proteins, were identified as novel components of the vegetal mRNA localization machinery.They bind specifically to the localization elements of several different vegetally localizing Xenopus mRNAs of all three localization pathways and they are part of one RNP together with other localization proteins, such as Vg1RBP, XStaufen1, VgRBP60 and 40LoVe. Immuno-isolated ElrA/B RNPs reveal other interesting, novel components of the localizing RNPs, such as RAP42/46, XhermesR and SLBP2. In addition maternal mRNA masking proteins, namely FRGY2a/b and Xp54 were also identified implying that localized mRNAs may also be masked.Blocking of Elr-type protein binding by either localization element mutagenesis or antisense morpholino oligonucleotides mediated masking of their target RNA sequences inhibits vegetal localization in Xenopus oocytes. ElrA/B proteins are predominantly cytoplasmic, with ElrA showing weak expression in the nucleus but perhaps joining the RNP complex in the nucleus. ElrA/B is also enriched at the vegetal cortex, a feature found to be similarly exhibited by the various localization proteins identified.ElrA/B proteins were found to moderately upregulate translation, when tethered to the 3 UTR of a reporter mRNA in the oocytes, whilst XDE LE with mutations blocking ElrA/B binding has no significant alteration of translation. Analysis also shows ElrA/B binding to XDE LE has no significant effect on mRNA stability in the oocyte; however in the embryo, the mutant versions of XDE LE show reduce stability in PGCs compared to the wild type.
Keywords: Xenopus oocytes; mRNA localization; Elav proteins; Xdead end mRNA; RRM domain; Maternal mRNA; RNA binding proteins; RNA Transport
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Der gerichtete Transport spezifischer mRNAs ist ein
Mechanismus zur Herstellung von Asymmetrie, welche eine
wichtige biologische Rolle spielt. In Xenopus Oozyten
ist die Lokalisierung von mRNA zum vegetativen Kortex
sowohl für die Bildung der Keimblätter als auch die
Entwicklung der Keimzellen bedeutsam. Mittels einer
biochemischen Aufreinigungsstrategie, die auf der
Anreicherung von RNPs aufgrund ihrer Größe basiert,
wurden Xenopus Elr-Proteine, Homologe der
Hu/ELAV-Proteinfamilie, welche in vier Isoformen
vorliegen, als Komponenten der vegetativen
mRNA-Lokalisationsmaschinerie identifiziert.Diese Proteine binden spezifisch an die
Lokalisationselemente verschiedener Xenopus mRNAs aller
drei Lokalisationswege. Außerdem sind sie gemeinsam mit
anderen Lokalisationsproteinen, wie Vg1RBP, XStaufen1,
VgRBP60 und 40LoVe Teil eines
Ribonukleoprotein-Partikels (RNP). Immunopräzipitierte
ElrA/B-RNPs enthalten andere interessante, neue
Komponenten lokalisierter RNPs, wie z.B. RAP42/46,
XhermesR und SLBP2. Zusätzlich wurden maternale
mRNA-maskierende Proteine, nämlich FRGY2a/b und Xp54
identifiziert. Dies deutet auf eine Maskierung
lokalisierter mRNAs hin.Elr-Proteine binden stark an die lokalisierende
XDead End (XDE)-mRNA. Die Blockierung dieser Bindung
durch Mutagenese des Lokalisationselementes oder durch
maskierende antisense Morpholino-Oligonukleotide
inhibiert die vegetative Lokalisierung dieser mRNA in
Xenopus Oozyten. ElrA/B-Proteine liegen hauptsächlich
zytoplasmatisch vor, wobei ElrA auch schwach im Nukleus
lokalisiert ist. Möglicherweise wird es bereits im Kern
Teil des RNPs. Ebenso wie andere bekannte
Lokalisationsproteine sind ElrA/B außerdem am
vegetativen Kortex angereichert.Weiterhin wurde festgestellt, dass ElrA/B-Proteine
die Translation in Xenopus Oozyten leicht aktivieren,
wenn sie an die 3 UTR einer Reporter rekrutiert werden.
Vergleicht man allerdings die Translationsrate von
Reporter-mRNAs, welche das ElrA/B-bindende XDE LE
enthalten, mit Reportern, in denen die Bindung durch
Mutationen blockiert ist, kann kein signifikanter
Unterschied festgestellt werden. Weitere Analysen
zeigten außerdem, dass die Bindung von ElrA/B an das
XDE LE hat keinen signifikanten Einfluß auf die
mRNA-Stabilität in der Oozyte. Allerdings zeigen die
mutierten XDE LE-Fragmente eine verringerte Stabilität
in den primordialen Keinzellen.
Schlagwörter: Xenopus oozyten; mRNA lokalisation; Elav proteine; XDead end mRNA; RRM domäne; Maternal mRNA; RNA binde proteine; RNA Transport