Identification and Functional Characterization of Trans-acting Factors Involved in Vegetal mRNA Localization in Xenopus Oocytes

Abstract

Der gerichtete Transport spezifischer mRNAs ist ein Mechanismus zur Herstellung von Asymmetrie, welche eine wichtige biologische Rolle spielt. In Xenopus Oozyten ist die Lokalisierung von mRNA zum vegetativen Kortex sowohl für die Bildung der Keimblätter als auch die Entwicklung der Keimzellen bedeutsam. Mittels einer biochemischen Aufreinigungsstrategie, die auf der Anreicherung von RNPs aufgrund ihrer Größe basiert, wurden Xenopus Elr-Proteine, Homologe der Hu/ELAV-Proteinfamilie, welche in vier Isoformen vorliegen, als Komponenten der vegetativen mRNA-Lokalisationsmaschinerie identifiziert.Diese Proteine binden spezifisch an die Lokalisationselemente verschiedener Xenopus mRNAs aller drei Lokalisationswege. Außerdem sind sie gemeinsam mit anderen Lokalisationsproteinen, wie Vg1RBP, XStaufen1, VgRBP60 und 40LoVe Teil eines Ribonukleoprotein-Partikels (RNP). Immunopräzipitierte ElrA/B-RNPs enthalten andere interessante, neue Komponenten lokalisierter RNPs, wie z.B. RAP42/46, XhermesR und SLBP2. Zusätzlich wurden maternale mRNA-maskierende Proteine, nämlich FRGY2a/b und Xp54 identifiziert. Dies deutet auf eine Maskierung lokalisierter mRNAs hin.Elr-Proteine binden stark an die lokalisierende XDead End (XDE)-mRNA. Die Blockierung dieser Bindung durch Mutagenese des Lokalisationselementes oder durch maskierende antisense Morpholino-Oligonukleotide inhibiert die vegetative Lokalisierung dieser mRNA in Xenopus Oozyten. ElrA/B-Proteine liegen hauptsächlich zytoplasmatisch vor, wobei ElrA auch schwach im Nukleus lokalisiert ist. Möglicherweise wird es bereits im Kern Teil des RNPs. Ebenso wie andere bekannte Lokalisationsproteine sind ElrA/B außerdem am vegetativen Kortex angereichert.Weiterhin wurde festgestellt, dass ElrA/B-Proteine die Translation in Xenopus Oozyten leicht aktivieren, wenn sie an die 3 UTR einer Reporter rekrutiert werden. Vergleicht man allerdings die Translationsrate von Reporter-mRNAs, welche das ElrA/B-bindende XDE LE enthalten, mit Reportern, in denen die Bindung durch Mutationen blockiert ist, kann kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Weitere Analysen zeigten außerdem, dass die Bindung von ElrA/B an das XDE LE hat keinen signifikanten Einfluß auf die mRNA-Stabilität in der Oozyte. Allerdings zeigen die mutierten XDE LE-Fragmente eine verringerte Stabilität in den primordialen Keinzellen.