Characterization of the 95 kDa sperm adhesion protein
Charakterizierung des 95 kDa Spermienadhäsionsproteins
by Leonard Bull
Date of Examination:2004-01-22
Date of issue:2004-03-04
Advisor:PD Dr. Stephan Jansen
Referee:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Referee:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
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Description:Dissertation
Abstract
English
During the early stages of fertilisation, the interaction between the spermatozoa and the oocyte involves complex mechanism. The events of gamete recognition and binding triggers signal transduction which initiates biochemical pathways leading to fusion. This interaction is mediated by a plethora from molecules located at the cell surface and in the plasma membrane. In this work, the 95 kDa sperm adhesion receptor protein was characterized in Sus scrofa.By means of Northern- and RT-PCR assays the expression of the 95 kDa sperm adhesion protein was examined in 6 different porcine tissues. It was found that the protein is exclusively expressed in the testicular cells at the postmeiotitic phase of development.In order to understand the evolution and predict the function of the 95 kDa sperm adhesion protein a phylogenetic tree (rooted tree) using the amino acid sequence of the conserved catalytic domain was plotted. Thirteen already characterized protein kinase were included in the tree.In addition, information obtained from the alignment of nucleotide sequences, confirmed the classification of the 95 kDa sperm adhesion protein to the tyrosine kinase receptor family.These results revealed the characteristic features of the family, which are highly conserved short-stretches of amino acids, presence of phosphotyrosine residues, and a single pass transmembrane protein with two functional sites. The extracellular site specifically binds ZP3 while the intracellular has tyrosine kinase enzymatic activity, which is stimulated when the protein binds ZP3. This knowledge serves as a major first step towards the understanding of the role of the sperm adhesion protein during the early stages of fertilization.Furthermore, to analyse the genomic structure of the 95 kDa gene, primers derived from human 95 kDa mRNA were designed to screen porcine genomic libraries. A positive PAC clone was isolated and the gene sequenced. The 95 kDa gene consists of 7 exons with exon 6 spanning the entire catalytic domain which is highly conserved in mammalian. Screening of the somatic- and radiation hybrid panel assigned the gene to chromosome 3q11-12. This was confirmed by FISH analysis. However, no synteny was confirmed between the q arms of chromosomes HSA and SSC.The data presented in this work confirmed the classification of the 95 kDa sperm adhesion protein and provides new insights in its function, genomic structure and chromosomal localization.
Keywords: Zona pellucida binding proteins (ZBP); 95 kDa sperm adhesion protein; Fertilisation; Spermatozoa
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Während der Frühphase der Befruchtung interagieren
die Eizelle und das Spermatozoon in komplexer Weise.
Die männlichen und weiblichen Gameten müssen sich
erkennen, aneinander binden und Signale austauchen, die
eine ganze Reihe von biochemischen Reaktionen nach sich
ziehen und letztendlich zur Fusion führen. Diese
Interaktionen werden von spezialisierten Mölekülen
übernommen, die auf den Oberflächen sowie auf den
Membranen der Gameten lokalisiert sind. In dieser
Arbeit wurde das 95 kDa Spermadhäsionsprotein in Sus
scrofa characterisiert.Mittels detaillierter Northern- und RT-PCR Analysen
wurde die Expression der 95 kDa Spermadhäsionprotein in
6 verschiedenen Geweben untersucht. Es konnte gezeigt
werden, dass das Protein ausschließlich in den
testicular Keimzellen exprimiert wird, während der
postmeiotitischen Phase.Um die phylogenetische Evolution des 95 kDa
Spermadhäsionsproteins besser zu verstehen und seine
Funktion nachzuvollziehen, wurde mit Hilfe der
Animosäurensequenz ein phylogenetischer Stammbaum der
konservativen katalytischen Domäne erstellt. Dreizehn
bereits charakterisierte Proteinkinasen wurden
hinzugezogen.Außerdem bestätigten Ergebnisse aus dem
Homologieergleich der Nukleotidsequenzen, dass das 95
kDa Spermadhäsionsprotein zur Gruppe der
Tyrosin-Rezeptorkinasen gehört.
Die Untersuchungen zeigten die wesentlichen Merkmale
dieser Proteingruppe, wie die stark konservierten
kurzsträngigen Aminosäuren, Vorhandensein von
Phosphotyrosinreste und einem einmal durchquerenden
Transmembranprotein mit zwei funktionalen
Bindungsstellen. An der extrazellulären Stelle bindet
spezifisch ZP3, während die intrazelluläre Stelle
enzymatische Tyrosinkinase aktivitäten zeigt, die bei
der Bindung von ZP3 aktiviert werden. Dieses Wissen
dient als Grundlage für das Verständnis der Rolle des
Spermadhäsionsproteins in der Frühphase der
Befruchtung.Ausserdem wurden, um die Genomstruktur des 95 kDa
Gens zu analysieren, Primern aus humaner 95 kDa mRNA
zur Screenen porcine Genombibliotheken hergeleitet. Ein
positiver PAC-Klon wurde isoliert und anschließend
sequenziert. Das 95 kDa Gen besteht aus sieben exons,
wobei exon sech die gesamte in Säugetieren stark
konservierten katalytische Domäne überspannt. Die
Screenen der somatic- and radiation hybrid panels
katiert das Gen dem Chromosom 3q11-12. Dies wurde durch
FISH-Analysen bestätigt. Es wurde jedoch keine Syntenie
zwischen der q arme der Chromosome HSA und SSC
festgestellt.Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigten die
Klassifikation des 95 kDa Spermadhäsionsproteins und
lieferten neue Erkenntnisse über ihre Funktion,
Genomstruktur und chromosomale Lokalisation.
Schlagwörter: 500 Naturwissenschaften allgemein; Zona pellucida bindende Proteine (ZBP); 95 kDa spermadhäsionsprotein; Befruchtung; Spermatozoen