dc.contributor.advisor | Kietzmann, Thomas Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Ganjam, Goutham Kumar | de |
dc.date.accessioned | 2012-05-16T12:09:56Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:51:28Z | de |
dc.date.issued | 2008-10-13 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B64B-C | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1335 | |
dc.description.abstract | Die Glucokinase (GK), auch Hexokinase-IV,
katalysiert die Phosphorylierung von Glucose zu
Glucose-6-phosphat. Im Gengensatz zu anderen
Hexokinasen hat die GK eine geringe Affinität für
Glucose, wird durch das Reaktionsprodukt nicht gehemmt
und weist eine sigmoidale Kinetik auf, obwohl sie als
Monomer vorliegt. Defekte im GK-Gen führen zum
maturity-onset diabetes of the young type-2
(Insulin-unabhängig [MODY-2]). So spielt die GK eine
wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der
Glucose-Homeostase. Die GK wird vorwiegend in
Leber-Hepatozyten, β-Zellen des Pankreas und in einigen
neuroendokrinen Zellen des Gastrolintestinaltrakts und
des Gehirns exprimiert. In Hepatozyten sind
hauptsächlich Insulin und Glucagon für die Regulation
der GK-Expression verantwortlich. Hierbei agiert
Insulin vorwiegend über den PI3K/PKB-signalweg und
moduliert die Aktivität verschiedener
Transkriptionsfaktoren, wie z.B. dem Sterol regulatory
element binding protein-1 (SREBP-1) und den
FoxO/forkhead Transkriptionsfaktoren. Neuere
Veröffentlichungen deuten darauf hin, dass sowohl
SREBP-1 als auch FoxO1 in antagonistischer Weise die
GK-Expression und somit den Glucose-/Lipid-Metabolismus
in der Leber beeinflussen. Die genauen Details der
SREBP-1 und FoxO1-regulierten GK-Genexpression sind
allerdings noch nicht bekannt.
Das Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung der
Insulin-abhängigen SREBP-1 und FoxO1- vermittelten
Expression des GK-Gens in primären Rattenhepatozyten
und in den Hepatomazellen HepG2. Die Stimulation von
primaren Rattenhepatozyten mit Insulin induzierte die
Expression von GK und SREBP-1. Auch konnte SREBP-1
durch eine Behandlung mit dem LXR-Agonisten TO-901317
induziert werden, was wiederum zu einer Induktion der
GK-mRNA Spiegel führte. Computer-Analysen des
Leber-spezifischen GK-Promotors zeigten 3 putative
SREBP-1 Bindungsstellen (SREs) auf.
Transfektionsversuche mit Luciferasegen-Konstrukten,
welche durch seriell deletierte GK-Promotoren reguliert
werden, deuteten darauf hin, dass eine Sequenz, bekannt
als Footprint-B-Seite, in die SREBP-1-abhängige
Regulation involviert ist. Weitere Analysen der
Footprint-B-Seite, welche in Abschnitt 1 und Abschnitt
2 unterteilt werden kann, zeigten, dass vor allem
Abschnitt 2 und weniger Abschnitt 1 für den SREBP-1
Effekt notwendig ist. Des Weiteren konnten durch
Mutationsanalysen des GK-Promotors zwei andere
Sequenzen, SRE2 und SRE3, identifiziert werden.
Transfektionsversuche in primären Hepatozyten und in
HepG2-Zellen implizieren, dass diese Elemente
Zell-spezifisch verwendet werden. Während in primären
Hepatozyten sowohl SRE2 als auch SRE3 für die SREBP-1
vermittelte GK-Promotoraktivität wichtig sind, trägt in
HepG2-Zellen nur SRE2 zum SREBP-1-Effekt bei. Zudem
ging die SREBP-1-vermittelte Aktivierung des
GK-Promotors durch Mutation des HNF-4-Bindungselements
verloren, was darauf hindeutet, dass für die
vollständige Induktion der GK-Genexpression durch
SREBP-1 eine Interaktion dieser Transkriptionsfaktoren
notwendig ist. Insulin hat einen dynamischen Effekt auf
die FoxO-Transkriptionsfaktoren, welche durch eine
PKB-abhängige Phosphorylierung in eine inaktive Form
überführt werden und so aus dem Kern ausgeschlossen
werden. Hepatozyten, welche mit
FoxO1-Expressionsvektoren transfiziert wurden,
regulierten ihre GK-mRNA und GK-Promotoraktivität
herab. Diese Repression ging durch Stimulation der
Hepatozyten mit Insulin verloren. Bekamen Ratten für
48h kein Futter, so war das GK-Protein kaum
detektierbar, allerdings war der FoxO1 Proteinspiegel
erhöht. Es ist bekannt, dass die transkriptionelle
Aktivität der FoxO-Proteine neben Insulin auch durch
NAD+ abhängige SIRT1 Deacetylierung reguliert wird.
Resveratrol reguliert die mRNA- und Proteinspiegel der
GK herab und kehrt den induzierenden Effekt von Insulin
um. Ähnliche Resultate wurden für die GK-Enzymaktivität
beobachtet. Computer-Analysen des GK-Promotors
prognostizierten zwei FoxO1-Bindungselemente (FBEa und
FBEb). Überexpression von FoxO1 vermindert die
GK-Promotoraktivität in primaren Hepatozyten und in
HepG2-Zellen. Mutationen im FoxO1-Bindungselement FBEb
beseitigen die FoxO1 vermittelte Repression des
GK-Promotors. Des Weiteren führt die Behandlung von
Hepatozyten mit dem SIRT1-Aktivator Resveratrol zur
Deacetylierung und Aktivierung von FoxO1. Interessanter
Weise ging der FoxO1-Effekt auch verloren, wenn die
HNF4-Bindungsstelle mutiert war. Dies suggerierte, das
FoxO1 mit HNF-4 interagiert und dessen Aktivität
reguliert.
Insgesamt zeigt die Studie, dass SREBP-1 die
GK-Genexpression über die Footprint-B2-Seite, SRE2 und
über Interaktion mit HNF-4 aktivieren kann. Obwohl die
Interaktion mit HNF-4 auch für die FoxO1-abhängige
Regulation des GK- Promotor wichtig ist, konnten zwei
zusätzliche Bindungsstellen identifiziert werden. Zum
ersten Mal konnte gezeigt weden, dass die
FoxO1-Aktivität durch Resveratrol und SIRT1 reguliert
wird und dass die Resveratrol-vermittelte Reduktion der
GK-Expression auf einer Bindung von FoxO1 am
Bindungselement oder auf einer Interaktion mit HNF-4
beruht. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html | de |
dc.title | Regulation of rat Liver Glucokinase Gene Expression by Sterol Regulatory Element Binding Protein-1a and Forkhead box classO1 Transcription factors | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.contributor.referee | Hardeland, Rüdiger Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2007-11-01 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften allgemein | de |
dc.description.abstracteng | Glucokinase (GK) also known as hexokinase IV
catalyzes phosphorylation of glucose to
glucose-6-phosphate. In contrast to other hexokinases,
GK has a low affinity for glucose, is not inhibited by
its reaction product and, although existing as monomer,
displays sigmoidal kinetics. Defects in the GK gene
lead to maturity-onset diabetes of the young type 2
(non-insulin-dependent [MODY-2]). Thus, GK plays an
important role for maintenance of glucose homeostasis.
GK is predominantly expressed in hepatocytes of the
liver, pancreatic -cells and some neuroendocrine cells
of the gastrointestinal tract and the brain. Insulin
and glucagon are the major hormones regulating
expression of GK in hepatocytes. Thereby, insulin acts
mainly via the PI3K/PKB pathway and modulates the
activity of several transcription factors such as
sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1)
and FoxO/forkhead transcription factors (FoxO). Recent
reports from cell culture experiments and transgenic
mice indicated that both SREBP-1 and FoxO1 may act in
an antagonistic fashion on GK expression and thus on
hepatic glucose/lipid metabolism. However, the complete
details of the SREBP-1 and FoxO1 regulated GK gene
expression are not yet known.
Therefore, it was the aim of this study to investigate,
the insulin-dependent SREBP-1- and FoxO1-mediated GK
gene expression at the molecular level in primary rat
hepatocytes and HepG2 hepatoma cells. Stimulation of
primary hepatocytes with insulin induced GK and SREBP-1
expression. Similarly SREBP could be induced by
treatment with the LXR agonist TO901317 which in turn
induced GK mRNA levels. Likewise, overexpression of
SREBP-1 in hepatocytes induced GK mRNA levels. Computer
analysis of the liver-specific GK promoter revealed
three putative SREBP-1 binding sites (SREs).
Transfection experiments in hepatocytes and HepG2 cells
with luciferase gene constructs driven by serially
deleted GK promoter fragments indicated that a sequence
known as the footprint B site is critically involved in
SREBP-1-dependent regulation. Further analysis of the
footprint B site which could be divided in part 1 and
part 2 showed that part 2 rather than part 1 is
necessary for the SREBP-1 effect. In addition, two
other sequences termed SRE2 and SRE3 were identified by
mutation analyses of GK promoter. Interestingly,
transfection data in primary hepatocytes and HepG2
cells implicated that these elements are utilized in a
cell-specific manner. While both SRE2 and SRE3 are
important for the SREBP-1-mediated GK promoter activity
in primary hepatocytes, only SRE2 contributed to the
SREBP-1 effect in HepG2 cells. Moreover, the
SREBP-1-mediated activation of the GK promoter was lost
upon mutation of the HNF-4 binding element indicating
that full induction of GK gene expression by SREBP-1
requires interaction of these transcription
factors.
Insulin has a dynamic effect on FoxO transcription
factors which are mediated by PKB-dependent
phosphorylation which lead to inactive FoxO by nuclear
exclusion. Hepatocytes transfected with FoxO1
expression vectors down regulated GK mRNA and GK
promoter activity and the repression was lost when
hepatocytes were stimulated with insulin. When rats
were fasted for 48 h the GK protein levels were nearly
undetectable, whereas FoxO1 protein levels were
induced. In addition to insulin, transcriptional
activity of FoxO proteins is known to be regulated by
NAD+-dependent SIRT1 deacetylases. Resveratrol down
regulated GK mRNA and protein levels and reversed the
inducing effects of insulin. Similar results were
observed with the GK enzyme activity. Computational
analysis of the GK promoter predicted two FoxO1 binding
elements (FBEa and FBEb). Overexpression of FoxO1
suppressed GK promoter activity in primary hepatocytes
and HepG2 cells. Mutations in the FoxO1 binding element
FBEb abolished the FoxO1-mediated repression of GK
promoter. Further, treatment of hepatocytes with the
SIRT1 activator resveratrol deacetylated and activated
FoxO1. Resveratrol also down regulated GK promoter
activity in transfected hepatocytes; it was unable to
repress promoter activity when FBEb was mutated.
Interestingly, the FoxO1 effect was also lost when the
HNF-4 binding site was mutated. This suggested that
FoxO1 interacts physically with HNF-4 to mediate its
action. Indeed, coimmunoprecipitation assays revealed
that FoxO1 physically interacts with HNF-4.
Together, the present study showed that SREBP-1 could
activate GK gene expression via the footprint B2 site,
SRE2 and interaction with HNF-4. Although interaction
with HNF-4 is also important for the FoxO1-dependent GK
promoter regulation, two additional binding sites were
identified. The FoxO1 activity was shown for the first
time to be regulated by resveratrol and SIRT1, and the
resveratrol-mediated down regulation of GK expression
was due to either binding of FoxO1 to the binding
elements or via interaction with HNF-4. | de |
dc.contributor.coReferee | Doenecke, Detlef Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Computer Science | de |
dc.subject.ger | Gene Expression | de |
dc.subject.ger | Glucokinase | de |
dc.subject.ger | Transkriptionsfaktoren | de |
dc.subject.eng | Gene Expression | de |
dc.subject.eng | Glucokinase | de |
dc.subject.eng | Transcription factors | de |
dc.subject.bk | 42.13 Molekularbiologie | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1910-7 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-1910 | de |
dc.affiliation.institute | Biologische Fakultät inkl. Psychologie | de |
dc.subject.gokfull | WF 200: Molekularbiologie | de |
dc.identifier.ppn | 600975436 | de |