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Regulation of rat Liver Glucokinase Gene Expression by Sterol Regulatory Element Binding Protein-1a and Forkhead box classO1 Transcription factors

dc.contributor.advisorKietzmann, Thomas Prof. Dr.de
dc.contributor.authorGanjam, Goutham Kumarde
dc.date.accessioned2012-05-16T12:09:56Zde
dc.date.available2013-01-30T23:51:28Zde
dc.date.issued2008-10-13de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B64B-Cde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1335
dc.description.abstractDie Glucokinase (GK), auch Hexokinase-IV, katalysiert die Phosphorylierung von Glucose zu Glucose-6-phosphat. Im Gengensatz zu anderen Hexokinasen hat die GK eine geringe Affinität für Glucose, wird durch das Reaktionsprodukt nicht gehemmt und weist eine sigmoidale Kinetik auf, obwohl sie als Monomer vorliegt. Defekte im GK-Gen führen zum maturity-onset diabetes of the young type-2 (Insulin-unabhängig [MODY-2]). So spielt die GK eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Glucose-Homeostase. Die GK wird vorwiegend in Leber-Hepatozyten, β-Zellen des Pankreas und in einigen neuroendokrinen Zellen des Gastrolintestinaltrakts und des Gehirns exprimiert. In Hepatozyten sind hauptsächlich Insulin und Glucagon für die Regulation der GK-Expression verantwortlich. Hierbei agiert Insulin vorwiegend über den PI3K/PKB-signalweg und moduliert die Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren, wie z.B. dem Sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) und den FoxO/forkhead Transkriptionsfaktoren. Neuere Veröffentlichungen deuten darauf hin, dass sowohl SREBP-1 als auch FoxO1 in antagonistischer Weise die GK-Expression und somit den Glucose-/Lipid-Metabolismus in der Leber beeinflussen. Die genauen Details der SREBP-1 und FoxO1-regulierten GK-Genexpression sind allerdings noch nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung der Insulin-abhängigen SREBP-1 und FoxO1- vermittelten Expression des GK-Gens in primären Rattenhepatozyten und in den Hepatomazellen HepG2. Die Stimulation von primaren Rattenhepatozyten mit Insulin induzierte die Expression von GK und SREBP-1. Auch konnte SREBP-1 durch eine Behandlung mit dem LXR-Agonisten TO-901317 induziert werden, was wiederum zu einer Induktion der GK-mRNA Spiegel führte. Computer-Analysen des Leber-spezifischen GK-Promotors zeigten 3 putative SREBP-1 Bindungsstellen (SREs) auf. Transfektionsversuche mit Luciferasegen-Konstrukten, welche durch seriell deletierte GK-Promotoren reguliert werden, deuteten darauf hin, dass eine Sequenz, bekannt als Footprint-B-Seite, in die SREBP-1-abhängige Regulation involviert ist. Weitere Analysen der Footprint-B-Seite, welche in Abschnitt 1 und Abschnitt 2 unterteilt werden kann, zeigten, dass vor allem Abschnitt 2 und weniger Abschnitt 1 für den SREBP-1 Effekt notwendig ist. Des Weiteren konnten durch Mutationsanalysen des GK-Promotors zwei andere Sequenzen, SRE2 und SRE3, identifiziert werden. Transfektionsversuche in primären Hepatozyten und in HepG2-Zellen implizieren, dass diese Elemente Zell-spezifisch verwendet werden. Während in primären Hepatozyten sowohl SRE2 als auch SRE3 für die SREBP-1 vermittelte GK-Promotoraktivität wichtig sind, trägt in HepG2-Zellen nur SRE2 zum SREBP-1-Effekt bei. Zudem ging die SREBP-1-vermittelte Aktivierung des GK-Promotors durch Mutation des HNF-4-Bindungselements verloren, was darauf hindeutet, dass für die vollständige Induktion der GK-Genexpression durch SREBP-1 eine Interaktion dieser Transkriptionsfaktoren notwendig ist. Insulin hat einen dynamischen Effekt auf die FoxO-Transkriptionsfaktoren, welche durch eine PKB-abhängige Phosphorylierung in eine inaktive Form überführt werden und so aus dem Kern ausgeschlossen werden. Hepatozyten, welche mit FoxO1-Expressionsvektoren transfiziert wurden, regulierten ihre GK-mRNA und GK-Promotoraktivität herab. Diese Repression ging durch Stimulation der Hepatozyten mit Insulin verloren. Bekamen Ratten für 48h kein Futter, so war das GK-Protein kaum detektierbar, allerdings war der FoxO1 Proteinspiegel erhöht. Es ist bekannt, dass die transkriptionelle Aktivität der FoxO-Proteine neben Insulin auch durch NAD+ abhängige SIRT1 Deacetylierung reguliert wird. Resveratrol reguliert die mRNA- und Proteinspiegel der GK herab und kehrt den induzierenden Effekt von Insulin um. Ähnliche Resultate wurden für die GK-Enzymaktivität beobachtet. Computer-Analysen des GK-Promotors prognostizierten zwei FoxO1-Bindungselemente (FBEa und FBEb). Überexpression von FoxO1 vermindert die GK-Promotoraktivität in primaren Hepatozyten und in HepG2-Zellen. Mutationen im FoxO1-Bindungselement FBEb beseitigen die FoxO1 vermittelte Repression des GK-Promotors. Des Weiteren führt die Behandlung von Hepatozyten mit dem SIRT1-Aktivator Resveratrol zur Deacetylierung und Aktivierung von FoxO1. Interessanter Weise ging der FoxO1-Effekt auch verloren, wenn die HNF4-Bindungsstelle mutiert war. Dies suggerierte, das FoxO1 mit HNF-4 interagiert und dessen Aktivität reguliert. Insgesamt zeigt die Studie, dass SREBP-1 die GK-Genexpression über die Footprint-B2-Seite, SRE2 und über Interaktion mit HNF-4 aktivieren kann. Obwohl die Interaktion mit HNF-4 auch für die FoxO1-abhängige Regulation des GK- Promotor wichtig ist, konnten zwei zusätzliche Bindungsstellen identifiziert werden. Zum ersten Mal konnte gezeigt weden, dass die FoxO1-Aktivität durch Resveratrol und SIRT1 reguliert wird und dass die Resveratrol-vermittelte Reduktion der GK-Expression auf einer Bindung von FoxO1 am Bindungselement oder auf einer Interaktion mit HNF-4 beruht.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleRegulation of rat Liver Glucokinase Gene Expression by Sterol Regulatory Element Binding Protein-1a and Forkhead box classO1 Transcription factorsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeHardeland, Rüdiger Prof. Dr.de
dc.date.examination2007-11-01de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaften allgemeinde
dc.description.abstractengGlucokinase (GK) also known as hexokinase IV catalyzes phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate. In contrast to other hexokinases, GK has a low affinity for glucose, is not inhibited by its reaction product and, although existing as monomer, displays sigmoidal kinetics. Defects in the GK gene lead to maturity-onset diabetes of the young type 2 (non-insulin-dependent [MODY-2]). Thus, GK plays an important role for maintenance of glucose homeostasis. GK is predominantly expressed in hepatocytes of the liver, pancreatic -cells and some neuroendocrine cells of the gastrointestinal tract and the brain. Insulin and glucagon are the major hormones regulating expression of GK in hepatocytes. Thereby, insulin acts mainly via the PI3K/PKB pathway and modulates the activity of several transcription factors such as sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) and FoxO/forkhead transcription factors (FoxO). Recent reports from cell culture experiments and transgenic mice indicated that both SREBP-1 and FoxO1 may act in an antagonistic fashion on GK expression and thus on hepatic glucose/lipid metabolism. However, the complete details of the SREBP-1 and FoxO1 regulated GK gene expression are not yet known. Therefore, it was the aim of this study to investigate, the insulin-dependent SREBP-1- and FoxO1-mediated GK gene expression at the molecular level in primary rat hepatocytes and HepG2 hepatoma cells. Stimulation of primary hepatocytes with insulin induced GK and SREBP-1 expression. Similarly SREBP could be induced by treatment with the LXR agonist TO901317 which in turn induced GK mRNA levels. Likewise, overexpression of SREBP-1 in hepatocytes induced GK mRNA levels. Computer analysis of the liver-specific GK promoter revealed three putative SREBP-1 binding sites (SREs). Transfection experiments in hepatocytes and HepG2 cells with luciferase gene constructs driven by serially deleted GK promoter fragments indicated that a sequence known as the footprint B site is critically involved in SREBP-1-dependent regulation. Further analysis of the footprint B site which could be divided in part 1 and part 2 showed that part 2 rather than part 1 is necessary for the SREBP-1 effect. In addition, two other sequences termed SRE2 and SRE3 were identified by mutation analyses of GK promoter. Interestingly, transfection data in primary hepatocytes and HepG2 cells implicated that these elements are utilized in a cell-specific manner. While both SRE2 and SRE3 are important for the SREBP-1-mediated GK promoter activity in primary hepatocytes, only SRE2 contributed to the SREBP-1 effect in HepG2 cells. Moreover, the SREBP-1-mediated activation of the GK promoter was lost upon mutation of the HNF-4 binding element indicating that full induction of GK gene expression by SREBP-1 requires interaction of these transcription factors. Insulin has a dynamic effect on FoxO transcription factors which are mediated by PKB-dependent phosphorylation which lead to inactive FoxO by nuclear exclusion. Hepatocytes transfected with FoxO1 expression vectors down regulated GK mRNA and GK promoter activity and the repression was lost when hepatocytes were stimulated with insulin. When rats were fasted for 48 h the GK protein levels were nearly undetectable, whereas FoxO1 protein levels were induced. In addition to insulin, transcriptional activity of FoxO proteins is known to be regulated by NAD+-dependent SIRT1 deacetylases. Resveratrol down regulated GK mRNA and protein levels and reversed the inducing effects of insulin. Similar results were observed with the GK enzyme activity. Computational analysis of the GK promoter predicted two FoxO1 binding elements (FBEa and FBEb). Overexpression of FoxO1 suppressed GK promoter activity in primary hepatocytes and HepG2 cells. Mutations in the FoxO1 binding element FBEb abolished the FoxO1-mediated repression of GK promoter. Further, treatment of hepatocytes with the SIRT1 activator resveratrol deacetylated and activated FoxO1. Resveratrol also down regulated GK promoter activity in transfected hepatocytes; it was unable to repress promoter activity when FBEb was mutated. Interestingly, the FoxO1 effect was also lost when the HNF-4 binding site was mutated. This suggested that FoxO1 interacts physically with HNF-4 to mediate its action. Indeed, coimmunoprecipitation assays revealed that FoxO1 physically interacts with HNF-4. Together, the present study showed that SREBP-1 could activate GK gene expression via the footprint B2 site, SRE2 and interaction with HNF-4. Although interaction with HNF-4 is also important for the FoxO1-dependent GK promoter regulation, two additional binding sites were identified. The FoxO1 activity was shown for the first time to be regulated by resveratrol and SIRT1, and the resveratrol-mediated down regulation of GK expression was due to either binding of FoxO1 to the binding elements or via interaction with HNF-4.de
dc.contributor.coRefereeDoenecke, Detlef Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerGene Expressionde
dc.subject.gerGlucokinasede
dc.subject.gerTranskriptionsfaktorende
dc.subject.engGene Expressionde
dc.subject.engGlucokinasede
dc.subject.engTranscription factorsde
dc.subject.bk42.13 Molekularbiologiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1910-7de
dc.identifier.purlwebdoc-1910de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 200: Molekularbiologiede
dc.identifier.ppn600975436de


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