Acyl-acyl carrier protein synthetases from bluegreen algae and plants

Abstract

Allen metabolischen Prozessen von Fettsäuren, geht deren Aktivierung zu einem Thioesterderivat voraus. Während die Aktivierung durch Acyl-CoA-Synthetasen in der Literatur gut etabliert ist, ist für die alternative Aktivierung mittels Acyl-Carrier-Protein bislang wenig Information verfügbar. Die Aufgabe dieser Arbeit war daher die Untersuchung von Acyl-ACP-Synthetase-Aktivitäten (AAS) in Cyanobakterien und höheren Pflanzen als Vertretern von photosynthetischen Organismen.In einer früheren Studie unserer Arbeitsgruppe konnten Acyl-ACP-Synthetasen aus Cyanobakterien identifiziert werden und ihre Aktivität nach heterologer Expression in Escherichia coli funktional charakterisiert werden. Die biologische Funktion dieser Aktivitäten konnte jedoch nicht ermittelt werden. In Arabidopsis wurden mit AAE15 und AAE16 zwei homologe Sequenzen gefunden. Beide Proteine wurden zuvor bereits bezüglich ihrer Rolle für die Elongation von exogenen Fettsäuren in Chloroplasten untersucht (Koo et al. 2005), jedoch legten die gewonnenen Daten lediglich für AAE15 eine AAS-Aktivität nahe.Um die biologische Funktion der AAS-Aktivität in Cyanobakterien zu untersuchen, wurden aas-Deletionsmutanten in den Stämmen Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus elongatus PCC 7942 hergestellt. Die erzeugten Mutanten zeigten zwei Phänotypen: Die Stämme waren unfähig exogene Fettsäuren aus dem Medium zu verwerten und sie sekretierten endogene Fettsäuren in das Kulturmedium. Durch Komplementation der aas-Mutante des Stammes Synechocystis sp. PCC 6803 mit dem aas Gen aus Synechococcus elongatus PCC 7942 konnte der Wildtyp-Status widerhergestellt werden. Die Analyse der extrazellulären und der intrazellulären Fettsäureprofile von Wildtyp und den aas-Mutanten Stämmen ergab, dass die gefundenen Fettsäuren aus Membranlipiden freigesetzt werden. Die gefundenen Daten deuten auf einen hohen Turnover dieser Lipide hin. Die AAS-Aktivität scheint für die Reaktivierung der freigesetzten Fettsäuren erforderlich zu sein mit dem Ziel diese Fettsäuren dem Lipidmetabolismus erneut verfügbar zu machen.Das Genom von Arabidopsis kodiert für zwei Sequenzen mit deutlicher Ähnlichkeit zu den AAS-Proteinen aus Cyanobakterien. Für diese beiden mit AAE15 und AAE16 benannten Proteine wurde mittels Expression von EYFP-Fusionsproteinen in Zwiebelzellen die Lokalisation in Plastiden nachgewiesen. Für eine weitergehende Charakterisierung wurden beide Proteine in Insektenzellen exprimiert und ihre Aktivität mittels in-vitro Enzymtests untersucht. Für AAE15 konnte AAS-Aktivität mit mittelkettigen Fettsäuren nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die aas-Mutante aus Synechocystis sp. PCC 6803 mit AAE15 und AAE16 komplementiert und die entstandenen Stämme anschließend für Fütterungsstudien mit Fettsäuren herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass die Komplementation mit AAE15 den Wildtyp-Phänotyp wieder herstellte. Zusätzlich wurde die Spezifität von AAE15 für mittelkettige Fettsäuren bestätigt. Die Komplementation mit AAE16 verlief ebenfalls erfolgreich und deutet eine breite Substratspezifität für dieses Protein an. In weiteren Studien wurde die Expression von AAE15 und AAE16 in Abhängigkeit von Gewebetypen und von Entwicklungsstadien untersucht. Die histochemischen GUS-Färbungen zeigten für AAE15 und AAE16 hochspezifische Expressionsprofile in verschiedenen Organen der Blüte und zusätzlich für AAE16 die Expression in Schließzellen. Diese Ergebnisse zeigen deutliche Diskrepanzen zu den Mikroarray-basierten Daten, die durch Genevestigator verfügbar sind.