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Functional Characterization of the Histone Methyltransferase and Methyl DNA Binding Protein MDU and its Role in Epigenetic Regulation of Rbf Gene in Drosophila Melanogaster

Funktionelle Charakterisierung von Histon-Methyltransferase und Methyl-DNA-Bindeprotein MDU sowie seine Rolle bei der epigenetischen Regulierung des Rbf-Gens in Drosophila melanogaster

by Dawei Gou
Doctoral thesis
Date of Examination:2008-10-30
Date of issue:2008-12-16
Advisor:Prof. Dr. Frank Sauer
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
Referee:Prof. Dr. Michael Kessel
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1342

 

 

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Size:3.81Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

The methylation of genomic DNA and histones is paramount for the execution of epigenetic events such as imprinting, gene dosage compensation, and gene silencing. Studies in fungi, plants and vertebrates support a model in which histone methylation, in particular methylation of lysines 9 (H3K9) and/or 27 in histone H3, instigates de novo DNA methylation. However, little is known about the mechanisms mediating de novo DNA methylation in model organisms such as Drosophila melanogaster. Drosophila expresses key components of the DNA and histone machineries: a.) Histone methyltransferases of the SET-domain family (HMTs), which methylate H3K9 and play crucial roles in hetero-chromatin formation and maintenance and gene silencing; b.) One DNA methyltransferase (dDNMT2) which preferentially methylates CpA- and CpT-motifs in the Drosophila genome c.) Methyl-CpG binding domain (MBD) proteins, which potentially bind methylated DNA and convert DNA methylation into biological function. One member of the Drosophila MBD-protein family is MDU, which contains a MBD and SET-domain, which methylates H3K9 in vitro and in the fly, raising the possibility that MDU is involved in the H3K9 and DNA methylation machineries of the fly. In this thesis I have investigated the role of MDU in gene expression and DNA methylation. In vitro HMT-assays coupled Western blot and chromatin immunoprecipitation assays reveal that the SET-domain of MDU tri-methylates H3K9 in vitro and in vivo. MDU-mediated methylation of H3K9 facilitates trasncriptional repression of target genes in Drosophila cells, revealing that MDU mediates gene silencing. The MBD of MDU associates with methylated CpA-motifs in vitro, indicating that the MBD of MDU has intrinsic methyl DNA binding activity. Molecular and genetic data reveal that MDU represses the transcription of the tumor suppressor gene retinoblastoma family protein (Rbf), a key regulator of cell proliferation and differentiation. The dissection of the role of MDU in regulation of Rbf expression supports a mode l in which tri-methylation of H3K9 by MDU triggers dDNMT2-mediated de novo DNA methylation at an enhancer region of the Rbf locus. Once DNA methylation has been placed, the MBD of MDU associates with methylated DNA and induces a self-perpetuating histone-DNA methylation cascade that results in spreading of DNA and histone methylation along the Rbf locus and ultimately culminates in silencing of Rbf transcription. The obtained results uncover a role for the MBD/SET protein MDU in gene silencing, provide a mechanism for establishment of de novo DNA methylation in Drosophila, and imply that bifunctional MBD/SET proteins play important roles in the control of cell proliferation and differentiation in development.
Keywords: histone methyltransferase(HMT); Methyl-CpG binding domain (MBD) Protein; Drosophila melanogaster

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Die Methylierung der genomischen DNA und Histonen im Kern eukaryotischer Zellen spielt eine wichtige Rolle in epigenetischen Prozessen wie z. B. Imprinting, Gene Dosage Compensation , und epigenetische Repression der Genexpression. Studien in Pilzen, Pflanzen und Vertebraten unterstützen ein Model, wonach die Methylierung von Histonen, insbesondere die Methylierung der Lysinreste 9 (H3K9) und/oder 27 im Histon 3, die de novo Methylierung von DNA auslöst. Im Gegensatz dazu, ist nur wenig über die Mechanismen bekannt, die für de novo Methylierung in Modelorganismen wie z. B. Drosophila melanogaster verantwortlich sind. Drosophila exprimiert Schlüsselfaktoren für die Methylierung von Histonen and DNA: a.) Histonmethyltransferasen (HMT), die H3K9 methylieren und entscheidende Rollen für die Etablierung and Aufrechterhaltung von Heterochromatin und Genrepression spielen; b.) Eine DNA-Methyltransferase (dDNMT2), die überwiegend CpA und CpT-Motive im Drosophila Genom methyliert; c.) Methyl-CpG binding domain (MBD) Proteine, die methylierte DNA binden und DNA Methylierung in biologische Aktivität übersetzen. Ein Mitglied der Drosophila MBD-Proteinfamilie ist Medusa (MDU), welches sowohl ein MBD- als auch ein SET-Motiv enthält. Das SET-Motiv methyliert H3K9 in vitro und In Drosophila. Die Anwesenheit eines MBD und Set Motivs in MDU unterstützt die Hypothese, dass MDU an der Methylierung von H3K9 und DNA in Drosophila beteiligt ist. In dieser Arbeit habe ich die funktionale Beduetung von MDU bezüglich der Genexpression and DNA Methylierung untersucht. In vitro HMT-Experimente gekoppelt mit Western blot and Chromatin Immunpräzipitationsexperimenten ergaben, dass MDU H3K9 in vitro und in vivo tri-methyliert. MDU-vermittellte Methylierung von H3K9 resultiert in Repression der Zielgentranskription in Drosophila Zellkultur, woraus abgeleitet werden kann, dass MDU als Repressor der Transkription wirkt. Das MBD-Motiv von MDU bindet methylierte CpA DNA Sequenzen in vitro, und besitzt eine intrinsische methylierte-DNA Binding saffinität. Die Ergebnisse molekularer and genetischer Studien zeigen, dass MDU die Transkription des Tumorsuppressor Gens retinoblastoma family protein (Rbf), einem Schlüsselregulator der Zellproliferation und differenzierung, reprimiert. Die Untersuchungen zur Funktion von MDU in der Regulation der Expression von Rbf unterstützen ein Model wonach tri-methylierung von H3K9 durch MDU die dDNMT2-abhängige de novo Methylierung in der cis-regulatorischen enhancer Region von Rbf auslöst. Sobald DNA Methylierung platziert ist, bindet das MBD-Motif von MDU an methylierte DNA und induziert eine selbstangetriebene DNA-Histone Mehtylierungskaskade, die zur Ausbreitung von DNA und H3K9 Methylierung auf dem Rbf Genlocus führt und letztendlich Repression der Rbf Transkription bewirkt. Die Ergebnisse dieser Arbeit entschlüsseln die Funktion von MDU in der Repression der Genexpression, ergeben einen Mechanismus für die Etablierung der de novo DNA Methylierung in Drosophila, und deuten auf eine wichtige Rolle der bifunktionalen MBD/SET Proteine für die Kontrolle der Proliferation und Differenzierung von Zellen hin.
Schlagwörter: Histonmethyltransferasen (HMT); Methyl-CpG binding domain (MBD) Proteine; Drosophila melanogaster
 

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