Functional Characterization of the Histone Methyltransferase and Methyl DNA Binding Protein MDU and its Role in Epigenetic Regulation of Rbf Gene in Drosophila Melanogaster

Abstract

Die Methylierung der genomischen DNA und Histonen im Kern eukaryotischer Zellen spielt eine wichtige Rolle in epigenetischen Prozessen wie z. B. Imprinting, Gene Dosage Compensation , und epigenetische Repression der Genexpression. Studien in Pilzen, Pflanzen und Vertebraten unterstützen ein Model, wonach die Methylierung von Histonen, insbesondere die Methylierung der Lysinreste 9 (H3K9) und/oder 27 im Histon 3, die de novo Methylierung von DNA auslöst. Im Gegensatz dazu, ist nur wenig über die Mechanismen bekannt, die für de novo Methylierung in Modelorganismen wie z. B. Drosophila melanogaster verantwortlich sind. Drosophila exprimiert Schlüsselfaktoren für die Methylierung von Histonen and DNA: a.) Histonmethyltransferasen (HMT), die H3K9 methylieren und entscheidende Rollen für die Etablierung and Aufrechterhaltung von Heterochromatin und Genrepression spielen; b.) Eine DNA-Methyltransferase (dDNMT2), die überwiegend CpA und CpT-Motive im Drosophila Genom methyliert; c.) Methyl-CpG binding domain (MBD) Proteine, die methylierte DNA binden und DNA Methylierung in biologische Aktivität übersetzen. Ein Mitglied der Drosophila MBD-Proteinfamilie ist Medusa (MDU), welches sowohl ein MBD- als auch ein SET-Motiv enthält. Das SET-Motiv methyliert H3K9 in vitro und In Drosophila. Die Anwesenheit eines MBD und Set Motivs in MDU unterstützt die Hypothese, dass MDU an der Methylierung von H3K9 und DNA in Drosophila beteiligt ist. In dieser Arbeit habe ich die funktionale Beduetung von MDU bezüglich der Genexpression and DNA Methylierung untersucht. In vitro HMT-Experimente gekoppelt mit Western blot and Chromatin Immunpräzipitationsexperimenten ergaben, dass MDU H3K9 in vitro und in vivo tri-methyliert. MDU-vermittellte Methylierung von H3K9 resultiert in Repression der Zielgentranskription in Drosophila Zellkultur, woraus abgeleitet werden kann, dass MDU als Repressor der Transkription wirkt. Das MBD-Motiv von MDU bindet methylierte CpA DNA Sequenzen in vitro, und besitzt eine intrinsische methylierte-DNA Binding saffinität. Die Ergebnisse molekularer and genetischer Studien zeigen, dass MDU die Transkription des Tumorsuppressor Gens retinoblastoma family protein (Rbf), einem Schlüsselregulator der Zellproliferation und differenzierung, reprimiert. Die Untersuchungen zur Funktion von MDU in der Regulation der Expression von Rbf unterstützen ein Model wonach tri-methylierung von H3K9 durch MDU die dDNMT2-abhängige de novo Methylierung in der cis-regulatorischen enhancer Region von Rbf auslöst. Sobald DNA Methylierung platziert ist, bindet das MBD-Motif von MDU an methylierte DNA und induziert eine selbstangetriebene DNA-Histone Mehtylierungskaskade, die zur Ausbreitung von DNA und H3K9 Methylierung auf dem Rbf Genlocus führt und letztendlich Repression der Rbf Transkription bewirkt. Die Ergebnisse dieser Arbeit entschlüsseln die Funktion von MDU in der Repression der Genexpression, ergeben einen Mechanismus für die Etablierung der de novo DNA Methylierung in Drosophila, und deuten auf eine wichtige Rolle der bifunktionalen MBD/SET Proteine für die Kontrolle der Proliferation und Differenzierung von Zellen hin.