Rezeptor-vermittelte Lieferung von Genen durch gezielte Liposomen und Quantum Dots
Receptor mediated gene delivery using targeted liposomes and Quantum Dots
by Valeria Sigot
Date of Examination:2008-07-02
Date of issue:2009-01-16
Advisor:Dr. Thomas Jovin
Referee:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
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Size:6.22Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The design of liposomal carriers for gene or drug delivery is an active field in current biomedical research. An important issue is the targetin of the c ach i
Keywords: Targeted liposomes; Quantum Dots; confocal fluorescence microscopy; EGF receptor
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Das Design von liposomalen Trägern für den Transport von Genen oder pharmakologischen Stoffen in Zellen hat einen großen Stellenwert in der biomedizinischen Forschung. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, Liposomen zielgerecht für nur die Zellen, die therapiert werden sollen, zu konstruieren. Die Kombination aus Liposomen mit speziellen Bildmarkern wie z. B. Quantenpunkten (QD = Quantum dot ) zu einem einzigem Nanoteilchen ergeben ein exzellentes Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen der Liposomenaufnahme. Mit verbessertem Verständnis dieser Mechanismen kann in Zukunft die Effizienz der Gen- oder Medikamentenaufnahme verbessert werden. Für den Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit wurden biotinylierte Lipidteilchen (BLP = Biotinylated Lipid Particle ) mit plasmidischer DNS beladen. Die Oberfläche der BLP wurde mit QD markiert, die ihrerseits mit dem Liganden EGF (Epidermaler Wachstumsfaktor = Epidermal Growth Factor ) funktionalisiert waren. In einem zweitem, gänzlich neuen Ansatz wurden die BLP mit rotleuchtenden QD655 gefüllt und die Oberfläche mit grünleuchtenden QD525 besetzt. Letzteres war wiederum mit einem EGF-Liganden markiert. Mit diesen zweiten Ansatz wurde beabsichtigt, die Spezifität der Bindung der BLPs an und ihrer Aufnahme in lebende Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Beide BLP-Arten waren auf A431 gerichtet, eine Zelllinie, die den EGF-Rezeptor (EGFR) überexprimiert. Weiterhin wurden Variationen der BLPs, die sich in der Zusammensetzung des schützenden Polymers PEG (Polyethylenglykol) unterschieden, in Bezug auf die Zellaufnahme getestet und optimiert. Die Kolokalisation der grünleuchtenden QD525 mit den rotleuchtenden QD655 erlaubte sowohl eine direkte Unterscheidung von ligandenbesetzen von ligandenfreien Teilchen, als auch die Bestimmung von freien EGF-QD525-Komplexen während der Aufnahme der lebenden Zellen. Verbesserte Bindung an Zellen und anschließende beschleunigte Aufnahme der mit QDs befüllten und ligandenbesetzen BLPs wurde beobachtet. Diese Beobachtung wurde mit der perinuklearen Lokalisierung der QDs in Verbindung gebracht, deren Anhäufungen über Tage bestanden. Dies war ein Anzeichen, dass die Nanopartikel aus den endosomalen Vesikeln nur mit Schwierigkeit freigesetzt werden konnten. Ligandenbesetzte BLPs, verglichen mit ligandenfreien, zu einer erhöhten Transfektion von A431 führten, unabhängig von den getesteten Lipidzusammensetzungen der Oberfläche. Zum Nachweis der Transfektion wurde die BLPs zuvor mit dem Plasmid für Grün Fluoreszierendem Protein (GFP = Green Fluorescent Protein ) befüllt. Dagegen war kein zielgerichteter Effekt der Liganten nachzuweisen, wenn den Zielzellen der entsprechende Rezeptor fehlte oder dieser durch überschüssige freie Liganden bereits belegt war. Beides zusammen zeigte, dass die verbesserte Zielbindung der BLPs durch Liganten/Rezeptor interaktion vermittelt wurde. In Hinsicht auf therapeutische Anwendungen mag die Spezifizität, die zweifach mit QD markierte BLPs für Tumorzellen, die den EGF-Rezeptor überexprimieren, zeigten, eine Basis für die zielgerichtete Überbringung von antikanzerogenen Medikamenten bilden. Mit diesem Ansatz wurde außerdem beabsichtigt, das Schicksal der Lipidpartikel in Echtzeit zu beobachten. Dieses wurde durch die Photostabilität und der hellen Fluoreszenz der QD ermöglicht. Die entwickelten BLP werden es ermöglichen, genauere Informationen über die bisher noch wenig verstandenen Bewegungsprozesse und subzelluläre Barrieren bei der Gen- und Medikamententransport durch liposomale Träger zu erhalten.
Schlagwörter: gezielte Liposomen; Quantenpunkten; konfokale Fluoreszenzmikroskopie; EGF-Rezeptor