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Optical Analysis of [Ca2+]i and Mitochondrial Signaling Pathways: Implications for the Selective Vulnerability of Motoneurons in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

dc.contributor.advisorHustert, Reinhold Prof. Dr.de
dc.contributor.authorJaiswal, Manoj Kumarde
dc.date.accessioned2012-05-16T12:10:21Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:50Zde
dc.date.issued2009-01-21de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B65A-Cde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-1347
dc.description.abstractAmyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fatale neurodegenerative Erkrankung, die durch den selektiven Verlust bestimmter Motoneuronen (MNs) im Hirnstamm und im Rückenmark gekennzeichnet ist. Diese Symptome findet man sowohl bei humaner ALS als auch bei entsprechenden Mausmodellen. Obwohl die komplexe Ätiologie von ALS noch nicht völlig verstanden ist, deuten zahlreiche Studien darauf hin, dass mitochondriale Fehlfunktionen und eine Störung der Ca2+-Homöostase kritische Punkte im Verlauf der Krankheit sind. Aus bisherigen Studien ist nur sehr wenig über die Rolle der Mitochondrien in der Ca2+ -Regulation in 8-9 Wochen alten HMNs (Hypoglossale Motoneuronen) und in 14-15 Wochen alten Wildtyp (WT) -Mäusen bzw. dem entsprechenden SOD1G93A -Mausmodell bekannt. Aus diesem Grund war das erste Ziel der vorliegenden Dissertation, die Rolle der Mitochondrien in der Ca2+-Singnalgebung zu beschreiben sowie die Rolle des Abbaus physiologischer Ca2+-Mengen in Hirnstammschnitten von ausgewachsenen SOD1G93A-Mäusen, die selektiv betroffene HMNs besitzen, im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern. Zweitens beabsichtigte diese Arbeit die zellulären und morphologischen Konsequenzen einer mitochondrialen Fehlfunktion in SH-SY5Y-Zellen zu untersuchen, die mit dem WT-SOD1 und dem SOD1G93A-Gen transfiziert wurden. Hierbei wurde ein besonderes Augenmerk auf eine Veränderung der Ca2+-Homöostase gelegt. Weiterhin wurde untersucht, ob Calbindin-D28K (CB-D28K) die Zellen vor Fehlfunktion und Degeneration schützt, indem es die [Ca2+]i (cytosolische Ca2+ -Konzentration) puffert. Die Rolle von Ca2+ als ein Risikofaktor wurde in Zellkultur primärer Neuronen, vom Tag E18, aus dem Cortex von Mäusen, die verschiedene Mengen (hohe und niedrige) an CB-D28K exprimieren untersucht. Es war bereits früher beschrieben worden, dass Ca2+-bindende Proteine wie CB-D28K und PV (Parvalbumin) in den Motoneuronenpopulationen fehlen, die im frühen Verlauf von ALS verloren gehen (HMNs/Spinale Motoneuronen(SMNs)). Schließlich wurde der Mechanismus und eine mögliche Rolle der Gliazellen im MN-Glia-Signalwechsel untersucht, der zum Tod von MN und Gliazellen führt, ausgelöst durch eine Änderung in der Glutamat-Signalgebung, durch Hopoxie oder mitochondriale Depolarization und wieweit dies klinisch bei ALS relevant ist.Um die zu Grunde liegenden Faktoren sowie die Konsequenzen mitochondrialer Fehlfunktion bei ALS auf die Membraneigenschaften von MN und die intrazelluläre Ca2+-Homöostase zu beschreiben, wurde eine schnelle Kamera basierte CCD-Bildgebungs-Technik eingesetzt. Mit dieser Technik wurden 8-9 und 14-15 Wochen alte Hirnstammschnitte von Mäusen, die selektiv verletzbare HMNs haben, die mit mSOD1G93A erhalten worden waren, und entsprechenende gesunde MN von WT-Wurfgeschwistern, untersucht. Bei den HMNs, die anfällig für den Zelltod bei ALS sind, induzierte eine Unterbrechung des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) durch den mitochondrialen Entkoppler FCCP (2µM) eine Ca2+ - Freisetzung aus mitochondrialen Vorräten, die signifikant in den HMNs bei SOD1G93A-Mäusen im symptomatischen Alter der Motordysfunktion (14-15 Wochen) verringert war. Die mitochondriale Ca2+ -Freisetzung nach FCCP-Applikation war in den WT-Mäusen fast ~3mal größer als bei den SOD1G93A-Tieren. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Ca2+ - Homöostase bei SOD1G93A-Mäusen signifikant gestört ist. Die Anwendung des SERCA-Inhibitors CPA, in der Gegenwart von FCCP, der ER- (Endoplasmatisches Retikulums) Ca2+ -Vorräte leert, resultierte in einer separat definierten Ca2+ -Freisetzung. Dies zeigt, dass die Vorräte im ER unabhängig von den der Mitochondrien agieren, aber signifikant kleiner und verschieden von der FCCP ausgelösten Ca2+ - Freisetzung sind. Der Effekt des ΔΨm war in Übereinstimmung mit einem Modell, bei dem das mutierte Gen eine erhebliche Störung von ΔΨm bei symptomatischen SOD1G93A-Mäusen auslöste, wogegen ΔΨm bei entsprecheneden WT und präsymptomatischen SOD1G93A-Tieren nicht betroffen war. Um die Rolle der Mitochondrien beim silmutanen Puffern der Ca2+ - Mengen im Cytosol und den Mitochondrien, zu bestimmen, wurden gleichzeitig die Ca2+-Mengen im Cytosol ([Ca2+]i) und in den Mitochondrien ([Ca2+]m) in SH-SY5Y Zellen, die mit dem WT oder dem SOD1G93A-Gen transfiziert worden waren, gemessen. Zuerst wurde [Ca2+]i gemessen, indem SH-SY5Y-Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 AM markiert wurden. Hierbei erwiesen sich flüssige Applicationen von 30mM KCl als reproduzierbar und erzeugten spannungsabhängige Ca2+ - Anstiege. Diese Reaktionen waren in wtSOD and mSOD1G93A exprimierenden Zellen vergleichbar. Im Gegensatz dazu, löste flüssige Verabreichung von FCCP eine signifikant kleinere (~1,86fach, n = 23 Zellen) intrazelluläre Ca2+ - Freisetzung in mSOD1 exprimierenden Zellen aus. Dies deutet darauf hin, dass die Calciumspeicherung in den Mitochondrien gestört ist. Um diese Idee weiter zu verfolgen, wurde ein CCD-Kamera Bildgebungs-System entwickelt, welches ermöglicht die [Ca2+]i (Fura-2) und die [Ca2+]m (Rhod-2) gleichzeitig mit einer zeitlichen Auflösung im Millisekundenbereich aufzunehmen. Dies erlaubt, die dynamischen Profile von [Ca2+]i und [Ca2+]m klar zu unterscheiden. Experimentelle Beobachtungen unter verschiedenen pharmakologischen Bedingungen (K+, FCCP und Koffein) unterstützen das Konzept, dass die mitochondriale Ca2+ -Regulation in Gegenwart von mSOD1 stark gestört ist.Um die Folgen der Puffercharakteristika von MN zu erklären (MN zeigen bei ALS eine niedrige Ca2+ -Pufferkapazität), wurden Ca2+ -Bildaufnahmestudien nach einem durch Depolarization induzieretem Stimulus (60mM K+) in primären Neuronenzellen, die CB-D28K exprimieren, durchgeführt. Unsere Daten weisen in der Tat darauf hin, dass CB-D28K die [Ca2+]i puffert, wohingegen hoch und niedrig transfizierte CB-D28K Zellen eine signifikante Reduktion (~2mal) der Peakamplitude des anhaltenden [Ca2+]i-Anstiegs aufweisen. Die Verminderung der Zeitkonstanste (τ) war in CB-D28K transfizierten Zellen ebenfalls geringer (~60s), im Gegensatz zu nicht transfizierten Zellen, wo die Regenerationszeit von der Nullausgangslinie zwischen ~30-35s beträgt. Dahingegen ist die Differenz in der Fläche unter der Zeit-Konzentrationskurve (AUC) nur sehr klein. Diese Differenz ist übereinstimmend mit der Low buffering Hypothesis , die besagt, dass niedrig konzentrierte Puffer in MN eine schnelle Ca2+ -Bewegung (Dynamik) während physiologischer Aktivität ermöglichen, aber einen signifikanten Risikofaktor bei ALS-artigen Erkrankungen darstellen. Weiterhin wurde eine vergleichende Untersuchung von Gliazellen, der MN-Glia-Signalinteraktion und dem Zusammenhang zwischen der [Ca2+]i, des ΔΨm und MNs-Glia-Wechselwirkungen durchgeführt. Wir entwickelten ein Protokoll, welches das parallele Beobachten von individuel ausgewählten MN und Gliazellen ermöglichte, somit konnte die physiologische Reaktion der zwei Zellarten im Netzwerk, in Schnitten aus dem Hirnstamm von Ratten, direkt verglichen werden. Diese Methode hat den Vorteil, dass auch sehr kleine Reaktionsunterschiede erkannt werden können, weil das MN-Glia-Netzwerk denselben experimentellen Bedingungen ausgesetzt ist. Wir fanden zwischen Gliazellen und MN signifikante Unterschiede im Ca2+ -Signaling. Bei mit Glutamat behandelten MN ist ein großer Anstieg der ROS (reaktiven Oxygen Species) parallel zu einem großen anhaltenden Glutatmat vermittelten Ca2+-Einstrom aus dem extra zellulären Raum zu verzeichenen, der gegenüber der Freisetzung aus Ca2+-Vorräten dominiert. In Gliazellen ist die Möglichkeit, die [Ca2+]i herunterzuregulieren, ein Schutz vor der Bildung von ROS. Dies bedeutet, dass eine hohe [Ca2+]i nicht notwendiger Weise toxisch für Glia und MN Netzwerke ist, und dass, die Potential vermittelte Aufnahme von Ca2+ notwendig ist, um einen NMDA Receptor vermittelten Zelltod auszulösen.Insgesamt schlagen die hier vorgestellten Resultate vor, dass ausgewachsene SOD1G93A -Mäuse eine erhebliche Störung im Wechselspiel der [Ca2+]i/ und dem Mitochondrium aufweisen und dass MN- Degeneration, die durch mSOD1 verursacht wird, ein Kennzeichnen langandauernder Änderung der Ca2+ -Homöostase und mitochondrialer Fehlfunktion ist. Diese Ergebnisse stimmen mit Modellen überein, die vorschlagen, dass eine Störung im Ca2+ /Mitochondriumsystem ein kritischer Faktor in der Pathogenese von ALS ist. Wenn diese Vorgänge komplet verstanden sind, wird dies zweifellos auch Hinweise zum besseren Verstehen der Prozesse, die an der MN-Degeneration beteiligt sind, geben. Dies wird folglich dazu betragen, therapeutische Strategien zu entwickeln, um selektiv die MN zu behandeln, die bei ALS betroffen sind.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/de
dc.titleOptical Analysis of [Ca<sup>2+</sup>]i and Mitochondrial Signaling Pathways: Implications for the Selective Vulnerability of Motoneurons in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)de
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedOptische Analysen von [Ca<sup>2+</sup>]i und mitochondrialen Signalwegen: Untersuchungen zur selektiven Verwundbarkeit von Motoneuronen in der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)de
dc.contributor.refereeSchürmann, Friedrich-Wilhelm Prof. Dr.de
dc.date.examination2008-01-23de
dc.subject.dnb500 Naturwissenschaften allgemeinde
dc.description.abstractengAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder characterized by selective loss of a defined motoneurons (MNs) population in the brain stem and spinal cord of both human ALS and corresponding mouse models of this neurodegenerative disease. While disruptions of [Ca2+]i and a strong interaction between metabolic mechanisms and mitochondria have been associated with selective MNs degeneration, the underlying mechanisms are only little understood. Although the complex etiologies of ALS are not yet fully understood, a variety of studies indicate that mitochondrial dysfunction and disruption of the Ca2+ homeostasis represent critical neuropathological characteristics during the disease progression. On the basis of the studies done so far, little is known about the involvement of mitochondria in Ca2+ regulation of HMNs in 8-9 and 14-15 weeks adult WT and corresponding SOD1G93A mice. Therefore, the first aim of this dissertation was to define and evaluate the contribution of mitochondria in Ca2+ signaling and clearance of physiological Ca2+ loads in adult brain stem slice preparations from SOD1G93A mice containing selectively vulnerable HMNs and to compare the results to the corresponding wild-type (WT) littermates. Second, the work aimed at characterizing the cellular and morphological consequences of mitochondrial dysfunction in SH-SY5Y cells transfected with WT-SOD1 and SOD1G93A gene, with special attention to alteration in Ca2+ homeostasis. Furthermore, in order to check if calbindin-D28K (CB-D28K) protects cells from dysfunction and degeneration via buffering of [Ca2+]i, Ca2+ involvement as a risk factor was studied in primary cultured neuronal cells at days E18 from cortex of mouse that expresses different levels of (low and high) CB-D28K , as was previously shown that Ca2+-binding proteins such as CB-D28K and PV are absent in MN populations (HMNs/SMNs) lost early in ALS. Finally, we intend to study the mechanisms and possible role of glia in MNs-glia signaling, leading to MNs and glial cell death as a consequence of alterations in glutamate signaling, hypoxia induced cell death, mitochondrial depolarization and their clinical relevance in ALS.To elucidate the underlying factors as well as consequences of mitochondrial dysfunction in ALS on MN membrane properties and intracellular Ca2+ homeostasis, we utilized rapid camera based CCD imaging techniques in 8-9 and 14-15 weeks adult brain stem slice preparations from mouse containing selectively vulnerable HMNs obtained from mSOD1G93A and corresponding healthy MNs in WT littermates. In the case of HMNs, which are vulnerable to cell death in ALS, disruption of the ΔΨm by bath application of the mitochondrial uncoupler FCCP(2µM) provoked a substantial Ca2+ release from mitochondrial stores which was significantly diminished in HMNs of SOD1G93A mice at symptomatic stage (14-15 weeks adult mice) of motor dysfunction. Mitochondrial Ca2+ release responses after FCCP application were almost ~3 fold larger in WT as compared to SOD1G93A animals, supporting the hypothesis that mitochondrial Ca2+ homeostasis is significantly disturbed in the SOD1G93A mice. The application of the SERCA inhibitor CPA to empty the ER Ca2+ store, in the presence of FCCP, resulted in a separate defined Ca2+ release, indicating that ER stores are able to operate independently of mitochondria, but are significantly small and different from FCCP evoked Ca2+ release. Responses of ΔΨm were in agreement with a model, where the presence of the mutated gene leads to a substantial disruption of the ΔΨmm in symptomatic SOD1G93A animals, whereas in corresponding 8-9 weeks WT and pre symptomatic mice ΔΨm remains identical. To evaluate the contribution of mitochondria in buffering Ca2+ loads simultaneously in cytosol and mitochondria, we simultaneously monitor cytosolic ([Ca2+]i) and mitochondrial calcium ([Ca2+]m) concentrations in SH-SY5Y cells transfected with either WT or mSOD1G93A gene. At first, [Ca2+]i was monitored by loading SH-SY5Y cells with the fluorescent dye Fura-2 AM where bath application of 30mM KCl evoked reproducible, voltage dependent Ca2+ elevations, and responses were comparable in wtSOD1 and mSOD1G93A expressing cells. In contrast, bath application of FCCP evoked significantly smaller (~1.86 fold, n = 23 cells) intracellular Ca2+ release responses in mSOD1 expressing cells, suggesting impaired mitochondrial calcium stores. To further test this idea, CCD camera imaging system that allows us to simultaneously monitor [Ca2+]i (Fura-2) and [Ca2+]m concentrations (Rhod-2) with a temporal resolution in millisecond time domain were developed. This permits us to clearly separate dynamic profiles of [Ca2+]i and [Ca2+]m. An experimental observation during different pharmacological conditions (K+, FCCP and Caffeine) supports the concept that the presence of mSOD1 severely disrupts mitochondrial Ca2+ regulation.To explain the consequences of buffering characteristics of MNs (The MNs in ALS showed a low Ca2+ buffering capacity), Ca2+ imaging studies following depolarization induced stimulus (60mM K+) were done in primary neuronal cells expressing CB-D28K. Our data shows that indeed CB-D28K buffers [Ca2+]i where low and high CB-D28K transfected cells display a significant (~2 times) reduction in the peak amplitude of the sustained [Ca2+]i increase. Decay time constant (τ) in CB-D28K transfected cells was also relatively slower (~60s) in contrast to non-transfected cells, where baseline recovery time is ~30-35s while showing little differences in the area under the time - concentration curve (AUC). The observation is in good agreement with the Low buffering hypothesis stating that low buffers provide MNs with rapid Ca2+ dynamics during physiological activity, but represents a significant risk factor during ALS-related MN disease. Further, we made a comparative study of glia, MN s-glia signaling and relationship between [Ca2+]i, ΔΨm and MNs-glia cross-talk. We develop a protocol which allows us a parallel observation of individually identified MNs and glial cells, and thus directly compare the physiological reactions in these two cell types in rat brain stem slice network. This procedure has a main advantage that even subtle differences in reactions can be outlined, because the MNs-glia networks are exposed to identical experimental conditions. We found significant differences between glial cell and MNs Ca2+ signaling. In glutamate treated MNs, the large rise in ROS generation is in parallel with large, sustained, glutamate-mediated Ca2+ influx from the extracellular space, which dominates over the Ca2+ release from the stores. In glial cells, the capacity to down regulate [Ca2+]i clearly provides protection against increased ROS generation. These results indicate that high levels of [Ca2+]i are not necessarily toxic to glia and MNs networks, and potential-driven uptake of Ca2+ into mitochondria is required to trigger NMDA receptor- stimulated neuronal death.Taken together, the results presented here suggest that adult SOD1G93A mouse are characterized by a substantial disruption of the [Ca2+]i / mitochondrial interplay and MN degeneration caused by mSOD1 may be attributed to long term exposures to altered Ca2+ homeostasis and mitochondrial dysfunction. These observations are in good agreement with the models suggesting that an impairment of the Ca2+/ mitochondrial system is a critical element of ALS pathogenesis. A thorough understanding of these events will undoubtedly give clues to a better understanding of the processes involved in MN degeneration and thus help in designing better therapeutic strategies to treat selectively vulnerable MNs in ALS.de
dc.contributor.coRefereeFicner, Ralf Prof. Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeHoppert, Michael PD Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerAmyotrophe Lateralsklerose (ALS)de
dc.subject.gerSuperoxid-Dismutase 1 (SOD1)de
dc.subject.gerMotoneuronerkrankungende
dc.subject.gerKalzium-Pufferde
dc.subject.gerMitochondriende
dc.subject.gerScheiben des Maushirnstammsde
dc.subject.gerCa<sup>2+</sup> imagingde
dc.subject.gerKonfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)de
dc.subject.gerMultiphoton-Lasermikroskopiede
dc.subject.gerImaging of mitochondriende
dc.subject.engAmyotrophic lateral sclerosis (ALS)de
dc.subject.engSuperoxide dismutase 1 (SOD1)de
dc.subject.engMotoneuron Diseasede
dc.subject.engCalcium buffersde
dc.subject.engMitochondriade
dc.subject.engBrainstem slicede
dc.subject.engCa<sup>2+</sup> imagingde
dc.subject.engConfocal laser scanning microscopy (CLSM)de
dc.subject.engMultiphoton microscopyde
dc.subject.engImaging of mitochondriade
dc.subject.bkBiologiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2005-2de
dc.identifier.purlwebdoc-2005de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullBiologyde
dc.identifier.ppn603733530de


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