dc.contributor.advisor | Hustert, Reinhold Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Jaiswal, Manoj Kumar | de |
dc.date.accessioned | 2012-05-16T12:10:21Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:50:50Z | de |
dc.date.issued | 2009-01-21 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B65A-C | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1347 | |
dc.description.abstract | Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fatale
neurodegenerative Erkrankung, die durch den selektiven
Verlust bestimmter Motoneuronen (MNs) im Hirnstamm und
im Rückenmark gekennzeichnet ist. Diese Symptome findet
man sowohl bei humaner ALS als auch bei entsprechenden
Mausmodellen. Obwohl die komplexe Ätiologie von ALS
noch nicht völlig verstanden ist, deuten zahlreiche
Studien darauf hin, dass mitochondriale Fehlfunktionen
und eine Störung der Ca2+-Homöostase
kritische Punkte im Verlauf der Krankheit sind. Aus
bisherigen Studien ist nur sehr wenig über die Rolle
der Mitochondrien in der Ca2+ -Regulation in
8-9 Wochen alten HMNs (Hypoglossale Motoneuronen) und
in 14-15 Wochen alten Wildtyp (WT) -Mäusen bzw. dem
entsprechenden SOD1G93A -Mausmodell bekannt.
Aus diesem Grund war das erste Ziel der vorliegenden
Dissertation, die Rolle der Mitochondrien in der
Ca2+-Singnalgebung zu beschreiben sowie die
Rolle des Abbaus physiologischer Ca2+-Mengen
in Hirnstammschnitten von ausgewachsenen
SOD1G93A-Mäusen, die selektiv betroffene
HMNs besitzen, im Vergleich zu WT-Wurfgeschwistern.
Zweitens beabsichtigte diese Arbeit die zellulären und
morphologischen Konsequenzen einer mitochondrialen
Fehlfunktion in SH-SY5Y-Zellen zu untersuchen, die mit
dem WT-SOD1 und dem SOD1G93A-Gen
transfiziert wurden. Hierbei wurde ein besonderes
Augenmerk auf eine Veränderung der
Ca2+-Homöostase gelegt. Weiterhin wurde
untersucht, ob Calbindin-D28K
(CB-D28K) die Zellen vor Fehlfunktion und
Degeneration schützt, indem es die [Ca2+]i
(cytosolische Ca2+ -Konzentration) puffert.
Die Rolle von Ca2+ als ein Risikofaktor
wurde in Zellkultur primärer Neuronen, vom Tag E18, aus
dem Cortex von Mäusen, die verschiedene Mengen (hohe
und niedrige) an CB-D28K exprimieren
untersucht. Es war bereits früher beschrieben worden,
dass Ca2+-bindende Proteine wie
CB-D28K und PV (Parvalbumin) in den
Motoneuronenpopulationen fehlen, die im frühen Verlauf
von ALS verloren gehen (HMNs/Spinale
Motoneuronen(SMNs)). Schließlich wurde der Mechanismus
und eine mögliche Rolle der Gliazellen im
MN-Glia-Signalwechsel untersucht, der zum Tod von MN
und Gliazellen führt, ausgelöst durch eine Änderung in
der Glutamat-Signalgebung, durch Hopoxie oder
mitochondriale Depolarization und wieweit dies klinisch
bei ALS relevant ist.Um die zu Grunde liegenden Faktoren sowie die
Konsequenzen mitochondrialer Fehlfunktion bei ALS auf
die Membraneigenschaften von MN und die intrazelluläre
Ca2+-Homöostase zu beschreiben, wurde eine
schnelle Kamera basierte CCD-Bildgebungs-Technik
eingesetzt. Mit dieser Technik wurden 8-9 und 14-15
Wochen alte Hirnstammschnitte von Mäusen, die selektiv
verletzbare HMNs haben, die mit mSOD1G93A
erhalten worden waren, und entsprechenende gesunde MN
von WT-Wurfgeschwistern, untersucht. Bei den HMNs, die
anfällig für den Zelltod bei ALS sind, induzierte eine
Unterbrechung des mitochondrialen Membranpotentials
(ΔΨm) durch den mitochondrialen Entkoppler FCCP (2µM)
eine Ca2+ - Freisetzung aus mitochondrialen
Vorräten, die signifikant in den HMNs bei
SOD1G93A-Mäusen im symptomatischen Alter der
Motordysfunktion (14-15 Wochen) verringert war. Die
mitochondriale Ca2+ -Freisetzung nach
FCCP-Applikation war in den WT-Mäusen fast ~3mal größer
als bei den SOD1G93A-Tieren. Dies
unterstützt die Hypothese, dass die Ca2+ -
Homöostase bei SOD1G93A-Mäusen signifikant
gestört ist. Die Anwendung des SERCA-Inhibitors CPA, in
der Gegenwart von FCCP, der ER- (Endoplasmatisches
Retikulums) Ca2+ -Vorräte leert, resultierte
in einer separat definierten Ca2+
-Freisetzung. Dies zeigt, dass die Vorräte im ER
unabhängig von den der Mitochondrien agieren, aber
signifikant kleiner und verschieden von der FCCP
ausgelösten Ca2+ - Freisetzung sind. Der
Effekt des ΔΨm war in Übereinstimmung mit einem Modell,
bei dem das mutierte Gen eine erhebliche Störung von
ΔΨm bei symptomatischen SOD1G93A-Mäusen
auslöste, wogegen ΔΨm bei entsprecheneden WT und
präsymptomatischen SOD1G93A-Tieren nicht
betroffen war. Um die Rolle der Mitochondrien beim
silmutanen Puffern der Ca2+ - Mengen im
Cytosol und den Mitochondrien, zu bestimmen, wurden
gleichzeitig die Ca2+-Mengen im Cytosol
([Ca2+]i) und in den Mitochondrien
([Ca2+]m) in SH-SY5Y Zellen, die mit dem WT
oder dem SOD1G93A-Gen transfiziert worden
waren, gemessen. Zuerst wurde [Ca2+]i
gemessen, indem SH-SY5Y-Zellen mit dem
Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 AM markiert wurden. Hierbei
erwiesen sich flüssige Applicationen von 30mM KCl als
reproduzierbar und erzeugten spannungsabhängige
Ca2+ - Anstiege. Diese Reaktionen waren in
wtSOD and mSOD1G93A exprimierenden Zellen
vergleichbar. Im Gegensatz dazu, löste flüssige
Verabreichung von FCCP eine signifikant kleinere
(~1,86fach, n = 23 Zellen) intrazelluläre
Ca2+ - Freisetzung in mSOD1 exprimierenden
Zellen aus. Dies deutet darauf hin, dass die
Calciumspeicherung in den Mitochondrien gestört ist. Um
diese Idee weiter zu verfolgen, wurde ein CCD-Kamera
Bildgebungs-System entwickelt, welches ermöglicht die
[Ca2+]i (Fura-2) und die [Ca2+]m
(Rhod-2) gleichzeitig mit einer zeitlichen Auflösung im
Millisekundenbereich aufzunehmen. Dies erlaubt, die
dynamischen Profile von [Ca2+]i und
[Ca2+]m klar zu unterscheiden.
Experimentelle Beobachtungen unter verschiedenen
pharmakologischen Bedingungen (K+, FCCP und
Koffein) unterstützen das Konzept, dass die
mitochondriale Ca2+ -Regulation in Gegenwart
von mSOD1 stark gestört ist.Um die Folgen der Puffercharakteristika von MN zu
erklären (MN zeigen bei ALS eine niedrige
Ca2+ -Pufferkapazität), wurden
Ca2+ -Bildaufnahmestudien nach einem durch
Depolarization induzieretem Stimulus (60mM
K+) in primären Neuronenzellen, die
CB-D28K exprimieren, durchgeführt. Unsere
Daten weisen in der Tat darauf hin, dass
CB-D28K die [Ca2+]i puffert,
wohingegen hoch und niedrig transfizierte
CB-D28K Zellen eine signifikante Reduktion
(~2mal) der Peakamplitude des anhaltenden
[Ca2+]i-Anstiegs aufweisen. Die Verminderung
der Zeitkonstanste (τ) war in CB-D28K
transfizierten Zellen ebenfalls geringer (~60s), im
Gegensatz zu nicht transfizierten Zellen, wo die
Regenerationszeit von der Nullausgangslinie zwischen
~30-35s beträgt. Dahingegen ist die Differenz in der
Fläche unter der Zeit-Konzentrationskurve (AUC) nur
sehr klein. Diese Differenz ist übereinstimmend mit der
Low buffering Hypothesis , die besagt, dass niedrig
konzentrierte Puffer in MN eine schnelle
Ca2+ -Bewegung (Dynamik) während
physiologischer Aktivität ermöglichen, aber einen
signifikanten Risikofaktor bei ALS-artigen Erkrankungen
darstellen. Weiterhin wurde eine vergleichende
Untersuchung von Gliazellen, der
MN-Glia-Signalinteraktion und dem Zusammenhang zwischen
der [Ca2+]i, des ΔΨm und
MNs-Glia-Wechselwirkungen durchgeführt. Wir
entwickelten ein Protokoll, welches das parallele
Beobachten von individuel ausgewählten MN und
Gliazellen ermöglichte, somit konnte die physiologische
Reaktion der zwei Zellarten im Netzwerk, in Schnitten
aus dem Hirnstamm von Ratten, direkt verglichen werden.
Diese Methode hat den Vorteil, dass auch sehr kleine
Reaktionsunterschiede erkannt werden können, weil das
MN-Glia-Netzwerk denselben experimentellen Bedingungen
ausgesetzt ist. Wir fanden zwischen Gliazellen und MN
signifikante Unterschiede im Ca2+
-Signaling. Bei mit Glutamat behandelten MN ist ein
großer Anstieg der ROS (reaktiven Oxygen Species)
parallel zu einem großen anhaltenden Glutatmat
vermittelten Ca2+-Einstrom aus dem extra
zellulären Raum zu verzeichenen, der gegenüber der
Freisetzung aus Ca2+-Vorräten dominiert. In
Gliazellen ist die Möglichkeit, die [Ca2+]i
herunterzuregulieren, ein Schutz vor der Bildung von
ROS. Dies bedeutet, dass eine hohe [Ca2+]i
nicht notwendiger Weise toxisch für Glia und MN
Netzwerke ist, und dass, die Potential vermittelte
Aufnahme von Ca2+ notwendig ist, um einen
NMDA Receptor vermittelten Zelltod auszulösen.Insgesamt schlagen die hier vorgestellten Resultate
vor, dass ausgewachsene SOD1G93A -Mäuse eine
erhebliche Störung im Wechselspiel der
[Ca2+]i/ und dem Mitochondrium aufweisen und
dass MN- Degeneration, die durch mSOD1 verursacht wird,
ein Kennzeichnen langandauernder Änderung der
Ca2+ -Homöostase und mitochondrialer
Fehlfunktion ist. Diese Ergebnisse stimmen mit Modellen
überein, die vorschlagen, dass eine Störung im
Ca2+ /Mitochondriumsystem ein kritischer
Faktor in der Pathogenese von ALS ist. Wenn diese
Vorgänge komplet verstanden sind, wird dies zweifellos
auch Hinweise zum besseren Verstehen der Prozesse, die
an der MN-Degeneration beteiligt sind, geben. Dies wird
folglich dazu betragen, therapeutische Strategien zu
entwickeln, um selektiv die MN zu behandeln, die bei
ALS betroffen sind. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/ | de |
dc.title | Optical Analysis of [Ca<sup>2+</sup>]i and Mitochondrial Signaling Pathways: Implications for the Selective Vulnerability of Motoneurons in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Optische Analysen von [Ca<sup>2+</sup>]i und mitochondrialen Signalwegen: Untersuchungen zur selektiven Verwundbarkeit von Motoneuronen in der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) | de |
dc.contributor.referee | Schürmann, Friedrich-Wilhelm Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2008-01-23 | de |
dc.subject.dnb | 500 Naturwissenschaften allgemein | de |
dc.description.abstracteng | Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal
neurodegenerative disorder characterized by selective
loss of a defined motoneurons (MNs) population in the
brain stem and spinal cord of both human ALS and
corresponding mouse models of this neurodegenerative
disease. While disruptions of [Ca2+]i and a
strong interaction between metabolic mechanisms and
mitochondria have been associated with selective MNs
degeneration, the underlying mechanisms are only little
understood. Although the complex etiologies of ALS are
not yet fully understood, a variety of studies indicate
that mitochondrial dysfunction and disruption of the
Ca2+ homeostasis represent critical
neuropathological characteristics during the disease
progression. On the basis of the studies done so far,
little is known about the involvement of mitochondria
in Ca2+ regulation of HMNs in 8-9 and 14-15
weeks adult WT and corresponding SOD1G93A
mice. Therefore, the first aim of this dissertation was
to define and evaluate the contribution of mitochondria
in Ca2+ signaling and clearance of
physiological Ca2+ loads in adult brain stem
slice preparations from SOD1G93A mice
containing selectively vulnerable HMNs and to compare
the results to the corresponding wild-type (WT)
littermates. Second, the work aimed at characterizing
the cellular and morphological consequences of
mitochondrial dysfunction in SH-SY5Y cells transfected
with WT-SOD1 and SOD1G93A gene, with special
attention to alteration in Ca2+ homeostasis.
Furthermore, in order to check if
calbindin-D28K (CB-D28K) protects
cells from dysfunction and degeneration via buffering
of [Ca2+]i, Ca2+ involvement as a
risk factor was studied in primary cultured neuronal
cells at days E18 from cortex of mouse that expresses
different levels of (low and high) CB-D28K ,
as was previously shown that Ca2+-binding
proteins such as CB-D28K and PV are absent
in MN populations (HMNs/SMNs) lost early in ALS.
Finally, we intend to study the mechanisms and possible
role of glia in MNs-glia signaling, leading to MNs and
glial cell death as a consequence of alterations in
glutamate signaling, hypoxia induced cell death,
mitochondrial depolarization and their clinical
relevance in ALS.To elucidate the underlying factors as well as
consequences of mitochondrial dysfunction in ALS on MN
membrane properties and intracellular Ca2+
homeostasis, we utilized rapid camera based CCD imaging
techniques in 8-9 and 14-15 weeks adult brain stem
slice preparations from mouse containing selectively
vulnerable HMNs obtained from mSOD1G93A and
corresponding healthy MNs in WT littermates. In the
case of HMNs, which are vulnerable to cell death in
ALS, disruption of the ΔΨm by bath application of the
mitochondrial uncoupler FCCP(2µM) provoked a
substantial Ca2+ release from mitochondrial
stores which was significantly diminished in HMNs of
SOD1G93A mice at symptomatic stage (14-15
weeks adult mice) of motor dysfunction. Mitochondrial
Ca2+ release responses after FCCP
application were almost ~3 fold larger in WT as
compared to SOD1G93A animals, supporting the
hypothesis that mitochondrial Ca2+
homeostasis is significantly disturbed in the
SOD1G93A mice. The application of the SERCA
inhibitor CPA to empty the ER Ca2+ store, in
the presence of FCCP, resulted in a separate defined
Ca2+ release, indicating that ER stores are
able to operate independently of mitochondria, but are
significantly small and different from FCCP evoked
Ca2+ release. Responses of ΔΨm were in
agreement with a model, where the presence of the
mutated gene leads to a substantial disruption of the
ΔΨmm in symptomatic SOD1G93A animals,
whereas in corresponding 8-9 weeks WT and pre
symptomatic mice ΔΨm remains identical. To evaluate the
contribution of mitochondria in buffering
Ca2+ loads simultaneously in cytosol and
mitochondria, we simultaneously monitor cytosolic
([Ca2+]i) and mitochondrial calcium
([Ca2+]m) concentrations in SH-SY5Y cells
transfected with either WT or mSOD1G93A
gene. At first, [Ca2+]i was monitored by
loading SH-SY5Y cells with the fluorescent dye Fura-2
AM where bath application of 30mM KCl evoked
reproducible, voltage dependent Ca2+
elevations, and responses were comparable in wtSOD1 and
mSOD1G93A expressing cells. In contrast,
bath application of FCCP evoked significantly smaller
(~1.86 fold, n = 23 cells) intracellular
Ca2+ release responses in mSOD1 expressing
cells, suggesting impaired mitochondrial calcium
stores. To further test this idea, CCD camera imaging
system that allows us to simultaneously monitor
[Ca2+]i (Fura-2) and [Ca2+]m
concentrations (Rhod-2) with a temporal resolution in
millisecond time domain were developed. This permits us
to clearly separate dynamic profiles of
[Ca2+]i and [Ca2+]m. An
experimental observation during different
pharmacological conditions (K+, FCCP and
Caffeine) supports the concept that the presence of
mSOD1 severely disrupts mitochondrial Ca2+
regulation.To explain the consequences of buffering
characteristics of MNs (The MNs in ALS showed a low
Ca2+ buffering capacity), Ca2+
imaging studies following depolarization induced
stimulus (60mM K+) were done in primary
neuronal cells expressing CB-D28K. Our data
shows that indeed CB-D28K buffers
[Ca2+]i where low and high
CB-D28K transfected cells display a
significant (~2 times) reduction in the peak amplitude
of the sustained [Ca2+]i increase. Decay
time constant (τ) in CB-D28K transfected
cells was also relatively slower (~60s) in contrast to
non-transfected cells, where baseline recovery time is
~30-35s while showing little differences in the area
under the time - concentration curve (AUC). The
observation is in good agreement with the Low
buffering hypothesis stating that low buffers provide
MNs with rapid Ca2+ dynamics
during physiological activity, but represents a
significant risk factor during ALS-related MN disease.
Further, we made a comparative study of glia, MN s-glia
signaling and relationship between [Ca2+]i,
ΔΨm and MNs-glia cross-talk. We develop a protocol
which allows us a parallel observation of individually
identified MNs and glial cells, and thus directly
compare the physiological reactions in these two cell
types in rat brain stem slice network. This procedure
has a main advantage that even subtle differences in
reactions can be outlined, because the MNs-glia
networks are exposed to identical experimental
conditions. We found significant differences between
glial cell and MNs Ca2+ signaling. In
glutamate treated MNs, the large rise in ROS generation
is in parallel with large, sustained,
glutamate-mediated Ca2+ influx from the
extracellular space, which dominates over the
Ca2+ release from the stores. In glial
cells, the capacity to down regulate [Ca2+]i
clearly provides protection against increased ROS
generation. These results indicate that high levels of
[Ca2+]i are not necessarily toxic to glia
and MNs networks, and potential-driven uptake of
Ca2+ into mitochondria is required to
trigger NMDA receptor- stimulated neuronal death.Taken together, the results presented here suggest
that adult SOD1G93A mouse are characterized
by a substantial disruption of the [Ca2+]i /
mitochondrial interplay and MN degeneration caused by
mSOD1 may be attributed to long term exposures to
altered Ca2+ homeostasis and mitochondrial
dysfunction. These observations are in good agreement
with the models suggesting that an impairment of the
Ca2+/ mitochondrial system is a critical
element of ALS pathogenesis. A thorough understanding
of these events will undoubtedly give clues to a better
understanding of the processes involved in MN
degeneration and thus help in designing better
therapeutic strategies to treat selectively vulnerable
MNs in ALS. | de |
dc.contributor.coReferee | Ficner, Ralf Prof. Dr. | de |
dc.contributor.thirdReferee | Hoppert, Michael PD Dr. | de |
dc.subject.topic | Mathematics and Computer Science | de |
dc.subject.ger | Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) | de |
dc.subject.ger | Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) | de |
dc.subject.ger | Motoneuronerkrankungen | de |
dc.subject.ger | Kalzium-Puffer | de |
dc.subject.ger | Mitochondrien | de |
dc.subject.ger | Scheiben des Maushirnstamms | de |
dc.subject.ger | Ca<sup>2+</sup> imaging | de |
dc.subject.ger | Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) | de |
dc.subject.ger | Multiphoton-Lasermikroskopie | de |
dc.subject.ger | Imaging of mitochondrien | de |
dc.subject.eng | Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) | de |
dc.subject.eng | Superoxide dismutase 1 (SOD1) | de |
dc.subject.eng | Motoneuron Disease | de |
dc.subject.eng | Calcium buffers | de |
dc.subject.eng | Mitochondria | de |
dc.subject.eng | Brainstem slice | de |
dc.subject.eng | Ca<sup>2+</sup> imaging | de |
dc.subject.eng | Confocal laser scanning microscopy (CLSM) | de |
dc.subject.eng | Multiphoton microscopy | de |
dc.subject.eng | Imaging of mitochondria | de |
dc.subject.bk | Biologie | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2005-2 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-2005 | de |
dc.affiliation.institute | Biologische Fakultät inkl. Psychologie | de |
dc.subject.gokfull | Biology | de |
dc.identifier.ppn | 603733530 | de |