A new rodent model of Parkinson s Disease based on neuron specific downregulation of glutathione production.
Ein neues Tiermodel der Parkinson´schen Erkrankung basierend auf neuronenspezifischer Herunterregulierung der Glutathion-Synthese.
von Manuel Joaquim Marques Garrido
Datum der mündl. Prüfung:2009-01-19
Erschienen:2009-04-21
Betreuer:Dr. Sebastian Kügler
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Heinrich
Gutachter:Prof. Dr. Frauke Melchior
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Parkinson s disease (PD) is characterized by a progressive degeneration of the nigrostriatal system. Only in few patients genetic mutations have been identified to cause disease onset, while the vast majority of cases remains idiopathic. The oxidative stress hypothesis claims that generation of neurotoxic oxidant species is crucially involved in disease onset and progression. In concordance with this hypothesis reduced levels of glutathione (GSH), the cell s most effective antioxidant, have been detected in the substantia nigra (SN) of PD patients. In an attempt to generate an animal model of PD closely resembling the human idiopathic situation, viral vector based RNA interference was used to down-regulate key enzymes of GSH synthesis in dopaminergic (DA) neurons of the rat SN in vivo. In vitro we developed experiments for the characterization of shRNA molecules efficacy. In primary neurons targeting the catalytic subunit (GCLc) or modulatory subunit (GCLm) of glutamate cysteine ligase (GCL) resulted in decreased glutathione levels which were correlated with neuronal impairment. In vivo we observed slowly progressive neurodegeneration which depended on the shRNA efficacy. The most effective shRNA targeting GCLc (GCLc-shRNA#2) induced 20% loss at 3 weeks, 35% loss at 6 weeks and 60% loss at 9 weeks compared with respective control shRNAs. The effect induced by GCLc-shRNA#2 was partially prevented by the expression of a non-targetable GCLc construct, thus demonstrating a specific knock-down mediated effect. We furthermore demonstrated that overexpression of GCLc and GCLm which may increase GSH production has neurodegenerative effects. Expression of these proteins resulted in dystrophic dendrites and induced approximately 30% DA neuron cell loss, thus indicating that a delicate balance of neuronal redox potential is essential for neuronal integrity. Our work demonstrated for the first time in vivo a direct evidence that the reduction of the DA neuron s antioxidative defence directly impairs neuronal survival. Moreo ver overexpression of each subunit of glutamate cysteine ligase in neurons by neuron-specific gene transfer into the SNpc resulted in DA neuron cell death. Taken together these results substantially corroborate the oxidative stress hypothesis of neurodegeneration in PD and strongly suggested that changes in the fine-tuned regulation of glutathione homeostasis may result in detrimental changes of cellular equilibriums.
Keywords: Glutathione; Adeno-Associated Virus; RNA interference; Parkinson s disease
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Der langsam fortschreitende Verlust dopaminerger
Neurone der Substantia Nigra stellt ein wesentliches
Merkmal der Parkinson´schen Erkrankung dar. Die Ursache
dieser Neurodegeneration ist nur in wenigen Fällen auf
Mutationen in rezessiv oder dominant vererbten Genen
zurückzuführen, die allermeisten Fälle sind sporadisch.
Die Theorie, dass oxidativer Stress eine wesentliche
Ursache der Neurodegeneration ist, wird durch
zahlreiche Befunde bestärkt, unter anderem durch die
Tatsache dass spezifisch in Parkinson-Patienten eine
Reduktion des Glutathionspiegels in der Substantia
Nigra nachweisbar ist. Glutathion ist das wichtigste
zelluläre Antioxidant, dessen Depletion also
möglicherweise ursächlich für die Degeneration nigraler
dopaminerger Neurone sein könnte. Um ein neues
Tiermodell der sporadischen Parkinson´schen Erkrankung
zu etablieren wurde mittels RNA-Interferenz in den
dopaminergen Neuronen der Substantia Nigra von Ratten
die Glutathion-Synthese gehemmt, und dadurch eine
langsam fortschreitende Degeneration dopaminerger
Neurone erreicht. Die Einbringung der die
RNA-Interferenz vermittelnden shRNAs in die Gehirne der
Tiere erfolgte mittels viraler Vektoren basierend auf
dem Adeno-Assoziierten Virus. Ebenfalls mittels AAV
Vektoren wurden Enzyme überexprimiert, die die
Glutathion Synthese verstärkten. In diese Experimenten
wurde ebenfalls eine Degeneration dopaminerger Neurone
beobachtet, was darauf hinweist dass der intraneuronale
Spiegel von Glutathion innerhalb sehr enger Grenzen
reguliert werden muss, um essentielle neuronale
Funktionen aufrechtzuerhalten. Diese Studie belegt zum
ersten Mal die eminent wichtige Funktion einer
funktionierenden Glutathion-Homeostase für das
Überleben dopaminerger Neurone im Gehirn von
Versuchstieren und wahrscheinlich von am Morbus
Parkinson erkrankten Patienten, und eröffnet somit neue
therapeutische Ansätze.
Schlagwörter: Glutathion; Adeno-Assoziierten Virus; RNA-Interferenz; Parkinson´schen Erkrankung