Study of genes of the phytopathogenic fungus Verticillium longisporum involved in the colonization of xylem vessels of its host Brassica napus
Untersuchung von Genen des pflanzen pathogenen Pilzes Verticillium longisporum, die in die Kolonisation der Xylem gefäßen von der host Brassica napus involviert sind
by Seema Singh
Date of Examination:2009-01-22
Date of issue:2009-04-22
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Andrea Polle
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Verticillium longisporum is a devastating soil - borne fungal pathogen of the rapeseed (Brassica napus). It colonizes the xylem vessels of the host plants but the nutritional status of the fungus and response to the plant defense mechanisms in the xylem vessel is largely unexplored.The gene for chorismate synthase of V. longisporum, Vlaro2 - 1 was isolated from the cDNA library of V. longisporum by performing a yeast complementation assay in &Delta aro2. Chorismate synthase is involved in the biosynthesis of the aromatic amino acids. As Vlaro2 - 1 complemented the bifunctional aro2 in yeast, it implied that the fungal enzyme is also bifunctional which means that apart from its catalytic activity it also possess an intrinsic NADPH : FMN oxidoreductase activity. It was determined that Vlaro2 - 1 has an isogene, Vlaro2 - 2 with identical sequence supporting a &lsquo near diploid &rsquo genome of V. longis porum. The deduced VlARO2 protein sequence of both isogenes is identical to the corresponding protein in V. dahliae. A novel knock - down method was established successfully in V. longisporum using RNA - mediated gene silencing to silence both isogenes of chorismate synthase which demonstrated that the gene silencing mechanism by RNAi works in the genus Verticillium. The Vlaro2 silenced mutant showed normal growth on minimal medium but marked growth retardation in the presence of 5 - methyl - DL - tryptophan, an inhibitor of the tryptophan biosynthesis as compared to the wild type. In a pathogenicity assay in Brassica napus, the propagation and virulence of the Vlaro2 silenced mutant was significantly reduced.The effect of the xylem sap of the host, Brassica napus on the protein expression of the pathogen, V. longisporum was further studied using a proteomic approach. The 2 - Dimensional Electrophoresis ( 2 - DE ) was conducted to identify the differentially expressed proteins of V.longisporum in the presence of the xylem sap. Fourteen proteins were observed to be differentially expressed in the 2 - DE analysis, of which six were upregulated and eight downregulated. For identification, MS / MS was employed and ten proteins were identified confidently. On functional analysis, it was observed that all the upregulated proteins may be involved in stress response. One of the upregulated proteins, catalase - peroxidase of V . longisporum, VlCPEA, was further characterized. V. longisporum has two isogenes, VlcpeA - 1 and VlcpeA - 2, which further supports its &lsquo near diploid &rsquo status. The catalase - peroxidase might play a role in protecting the fungus from the oxidative stress generated by the host plant.The development of a knock - down method for efficient gene silencing and the first characterization of two gene pairs presumably necessary for prototrophy or oxidative stress response are prerequisites for the further analysis of this fungus - plant interaction.
Keywords: Verticillium longisporum; Brassica napus; chorismate synthase; catalase peroxidase; proteomic analysis
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Verticillium longisporum ist ein
wirtsspezifischer pathogener Pilz, der Raps (
Brassica napus) infiziert. V. longisporum
befällt die Pflanzen über die Wurzeln, dringt in das
vaskuläre System der Pflanze ein und kolonisiert die
Xylemgefäße der Pflanze. Der Mechanismus der
Interaktion zwischen V. longisporum und der
Wirtspflanze ist noch weitgehend ungeklärt .Chorismat - Synthase ist an der Biosynthese von
aromatischen Aminosäuren beteiligt Das Gen für
Chorismat-Synthase Vlaro2 - 1 wurde mittels
einer cDNA-Genbank von V. longisporum durch
einen Komplementationstest im Hefestamm
&Deltaaro2 isoliert. Weil Vlaro2 - 1
das bifunktionelle Aro2 in Hefe komplementieren
kann, wird angenommen, dass das Enzym ebenfalls
bifunktionell ist, d. h. neben der katalytischen
Aktivität weist es eine spezifische NADPH : FMN
Oxidoreduktase - Aktivität auf . Es konnte gezeigt
werden, dass Vlaro2 - 1 ein Isogen
Vlaro2-2 mit identischer genomischer Sequenz
besitzt, welches erneut zeigt, dass V.
longisporum merodiploid ist. Die VLARO2 -
Proteinsequenz von beiden Isogenen ist identisch zu der
entsprechenden Proteinsequenz von V. dahliae .
Über RNA - vermitteltes &lsquo Gen-silencing
&rsquo wurde eine neue &lsquo knock - down
&rsquo Methode für V. longisporum
erfolgreich etabliert mit der die Transkription beider
Isogene der Chorismat - Synthase durch RNAi gehemmt
werden konnten, damit konnte gezeigt werden, dass RNAi
in V . longisporum möglich ist Im Vergleich mit
dem Wildtypstamm zeigte die Mutante Vlaro2
normales Wachstum auf Minimalmedium, aber verlangsamtes
Wachstum in Gegenwart von 5 - Methyl - DL - Tryptophan,
einem Tryptophan - Biosynthese - Inhibitor . Über einen
Pathogenitätstest in B. napus konnte gezeigt
werden, dass Wachstum und Virulenz der Mutante
Vlaro2 stark eingeschränkt waren.Die Wirkung von Xylemsaft des Wirtes B. napus
auf die Proteinexpression des Pathogens V.
longisporum wurde durch eine Proteom - Analyse
untersucht. Die 2 - dimensionale Gelelektrophorese ( 2
- DE ) wurde dazu genutzt, um die in Gegenwart von
Xylemsaft unterschiedlich exprimierten Proteine von
V . longisporumzu identifizieren. Hier wurden 14
Proteine gefunden, von denen 6 hochreguliert und 8
runterreguliert waren. Es wurde festgestellt, dass die
hochregulierten Proteine an der Stressantwort des
Pilzes beteiligt sein könnten. Eines der
hochregulierten Proteine Katalase - Peroxidase von
V. longisporum VlCPEA, wurde weiter
charakterisiert. V. longisporum hat auch hier
zwei Isogene VlcpeA - 1 und VlcpeA - 2.
Katalase - Peroxidase könnte bei durch die Pflanzen
verursachtem oxidativem Stress eine Schutzfunktion
ausüben. Die Entwicklung einer &lsquo knock - down
&rsquo Methode und die erste Charakterisierung der
beiden Genpaare für Prototrophie oder oxidative
Stressantwort, sind die Vorraussetzung für weitere
Untersuchungen dieser Pilz-Pflanzen Interaktion.
Schlagwörter: Verticillium longisporum; Brassica napus; Chorismate Synthase; Katalase-Peroxidase; Proteom-Analyse