Study of genes of the phytopathogenic fungus Verticillium longisporum involved in the colonization of xylem vessels of its host Brassica napus

Abstract

Verticillium longisporum ist ein wirtsspezifischer pathogener Pilz, der Raps ( Brassica napus) infiziert. V. longisporum befällt die Pflanzen über die Wurzeln, dringt in das vaskuläre System der Pflanze ein und kolonisiert die Xylemgefäße der Pflanze. Der Mechanismus der Interaktion zwischen V. longisporum und der Wirtspflanze ist noch weitgehend ungeklärt .Chorismat - Synthase ist an der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren beteiligt Das Gen für Chorismat-Synthase Vlaro2 - 1 wurde mittels einer cDNA-Genbank von V. longisporum durch einen Komplementationstest im Hefestamm &Deltaaro2 isoliert. Weil Vlaro2 - 1 das bifunktionelle Aro2 in Hefe komplementieren kann, wird angenommen, dass das Enzym ebenfalls bifunktionell ist, d. h. neben der katalytischen Aktivität weist es eine spezifische NADPH : FMN Oxidoreduktase - Aktivität auf . Es konnte gezeigt werden, dass Vlaro2 - 1 ein Isogen Vlaro2-2 mit identischer genomischer Sequenz besitzt, welches erneut zeigt, dass V. longisporum merodiploid ist. Die VLARO2 - Proteinsequenz von beiden Isogenen ist identisch zu der entsprechenden Proteinsequenz von V. dahliae . Über RNA - vermitteltes &lsquo Gen-silencing &rsquo wurde eine neue &lsquo knock - down &rsquo Methode für V. longisporum erfolgreich etabliert mit der die Transkription beider Isogene der Chorismat - Synthase durch RNAi gehemmt werden konnten, damit konnte gezeigt werden, dass RNAi in V . longisporum möglich ist Im Vergleich mit dem Wildtypstamm zeigte die Mutante Vlaro2 normales Wachstum auf Minimalmedium, aber verlangsamtes Wachstum in Gegenwart von 5 - Methyl - DL - Tryptophan, einem Tryptophan - Biosynthese - Inhibitor . Über einen Pathogenitätstest in B. napus konnte gezeigt werden, dass Wachstum und Virulenz der Mutante Vlaro2 stark eingeschränkt waren.Die Wirkung von Xylemsaft des Wirtes B. napus auf die Proteinexpression des Pathogens V. longisporum wurde durch eine Proteom - Analyse untersucht. Die 2 - dimensionale Gelelektrophorese ( 2 - DE ) wurde dazu genutzt, um die in Gegenwart von Xylemsaft unterschiedlich exprimierten Proteine von V . longisporumzu identifizieren. Hier wurden 14 Proteine gefunden, von denen 6 hochreguliert und 8 runterreguliert waren. Es wurde festgestellt, dass die hochregulierten Proteine an der Stressantwort des Pilzes beteiligt sein könnten. Eines der hochregulierten Proteine Katalase - Peroxidase von V. longisporum VlCPEA, wurde weiter charakterisiert. V. longisporum hat auch hier zwei Isogene VlcpeA - 1 und VlcpeA - 2. Katalase - Peroxidase könnte bei durch die Pflanzen verursachtem oxidativem Stress eine Schutzfunktion ausüben. Die Entwicklung einer &lsquo knock - down &rsquo Methode und die erste Charakterisierung der beiden Genpaare für Prototrophie oder oxidative Stressantwort, sind die Vorraussetzung für weitere Untersuchungen dieser Pilz-Pflanzen Interaktion.