Charakterisierung Subtyp-spezifischer Autophagieproteine

Abstract

Makroautophagie ist ein Prozess der eukaryotischen Organismen unter anderem das Überleben bei Nährstoffmangel sichert. Für Autophagie sind selektive Subtypen bekannt. Einer ist der Cvt (Cytoplasm to vacuole targeting)-Weg. Dieser ist unter Wachstumsbedingungen aktiv und transportiert spezifische Proteine unter Ausschluss von Zytosol in Cvt Vesikeln zur Vakuole. Für ihre Funktion benötigen alle Subtypen eine spezifische Auswahl von Autophagie- und weiteren assoziierten Proteinen. Mit Hilfe des Split-Ubiquitin System wurde in dieser Arbeit nach Interaktionspartnern für die Proteine Atg9 und das Atg21 gesucht. Mögliche Interaktionen mit Atg9 wurden vor allem mit Bestandteilen der ribosomalen 40S und 60S Untereinheit gefunden. Diese werden in der selektiven Ribophagie abgebaut. Unspezifische Interaktionen in diesem System scheinen auf Grund der räumlichen Nähe der Proteine bei diesem Prozess möglich. Für Atg21 wurde mit dem Split-Ubiquitin System neben vielen ribosomalen Proteinen auch Egd2 als möglicher Interaktionspartner entdeckt. Egd2Δ-Zellen zeigen jedoch keinen Cvt-Defekt. Die Lokalisierung von Atg21 ist in diesen Zellen ebenfalls nicht beeinträchtigt. Zudem zeigen egd2Δ-Zellen keinen Defekt bei der Vakuolenfragmentierung oder vererbung. Die drei sequenzhomologen Proteine Atg18, Atg21 und Ygr223c haben unterschiedliche Funktionen in autophagischen Prozessen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Vakuolenfragmentierung, als Antwort auf hyperosmotischen Stress, in atg18Δ-Zellen signifikant und atg21Δ-Zellen deutlich gestört ist. Ygr223cΔ-Zellen zeigen hingegen den Wildtypphänotyp. Die Vererbung der Vakuole in knospenden Zellen ist dagegen in allen drei Deletionsstämmen reduziert. Den drei Proteinen gemein ist das Phospatidylinositol-Phosphat (PIP)-Bindemotiv FRRG. Die Mutation zu FTTG in Atg18 und Atg21 führt zur fehlerhaften Lokalisierung in der Zelle. Zusätzlich verliert Atg18 die Fähigkeit an PI3P und PI(3,5)P2 zu binden. Dieses Motiv ist auch wichtig für die Fähigkeit zur Vakuole nfragmentierung. Atg18FTTG-Zellen zeigen den gleichen Phänotyp wie atg18Δ-Zellen. Die Überexpression von GFP-YGR223C bewirkt die Sekretion von CPY. Dies führte zur Annahme, dass überschüssiges Ygr223c einen unbekannten Faktor binden könnte, der für den CPY-Transport benötigt wird. Die gleichzeitige Überexpression dieses vermuteten Bindungspartners sollte den Defekt wieder aufheben. In einem CPY-Overlay-Assay mit Hilfe einer Überexpressions-Genbank konnte kein solcher Faktor identifiziert werden. Trs85 ist ein nicht-essentieller Bestandteil der TRAPP (transport protein particle)-Komplexe. In trs85Δ-Zellen ist der Cvt-Weg blockiert und Autophagie um 50% reduziert. Mit Hilfe der TAP (tandem affinity purification)-Methode sollte für Trs85 nach Bindungspartnern gesucht werden, um zu klären, ob Trs85 Bestandteil eines Cvt-spezifischen TRAPP Komplexes ist. Mit Bet3-TAP (als Kontrolle) konnte der TRAPP II Komplex fast vollständig isoliert werden. Für Trs58 konnten keine neuen Interaktionspartner identifiziert werden. Induzierter ER-Stress durch Inkubation von Zellen in Tunicamycin (TM) oder Dithitreitol (DTT) führt zur Induktion von ER-Phagie. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass viele zusätzliche Atg-Proteine und Autophagie-assozierte Proteine essentiell für das Wachstum unter ER-Stress sind. Weitere Deletionsstämme zeigten dazu eine signifikante Reduktion im Wachstum. ER-Phagie scheint keine echte Makroautophagie zu sein. Die Markerproteine für Autophagie, GFP-Atg8 und Pgk1-GFP, wurden unter ER-Stress nicht in der Vakuole abgebaut. Experimente zur Identifizierung eines geeigneten Markerproteins für die Analyse der ER-Phagie zeigten, dass Kar2, Sec63 und Sec61 keine geeigneten Markerproteine sind.