Impact of iron-deficiency upon behaviour and protein expression in the male mouse with implications for Restless Legs Syndrome
Der Einfluss von Eisenmangel auf Verhalten und Proteinexpression bei der männlichen Maus
Implikationen für das Restless-Legs-Syndrom
von Pascal Dowling
Datum der mündl. Prüfung:2009-03-31
Erschienen:2009-06-12
Betreuer:Prof. Dr. Walter Paulus
Gutachter:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:Prof. Dr. Gabriele Flügge
Gutachter:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Dateien
Name:dowling.pdf
Size:4.55Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Restless legs syndrome (RLS) comprises of both sensory and motor symptoms, observed as an increased pain and periodic jerking movement of the legs. There are two forms of RLS; one being the genetic (primary) form whereby 4 gene variants have been identified, the second form is non-genetically characterised (secondary), where iron-deficiency is of major importance. Dopaminergic therapy has a central role in treating both forms of RLS suggesting an important function of the dopaminergic system, which in turn is known to be dysregulated by iron-deficiency via iron dependence of tyrosine hydroxylase and the dopamine transporter. The aim of this thesis was to devise an animal model of secondary RLS and to correlate whether iron-deficiency is the inducing factor of the behavioural sensory and motor symptoms in-vivo.A nutritional deprivation of iron in C57Bl/6 wildtype (WT) and dopamine receptor 3 null (D3-/-) male mice was induced by an iron-deficient (ID) diet starting from post-natal day 28 (P28) and continuing for 1, 4, 8, 15 or 30 weeks duration. By using the hot-plate and formalin tests after 1, 4 and/or 15 weeks of ID diet, acute and persistent sensory responses were tested upon activation of primarily afferent Aδ- and C-fibres, respectively, where these fibres have been shown in clinical studies to be altered in both primary and secondary RLS patients. c-Fos immunoreactive (c-Fos-IR) cells at the ipsilateral horn were quantified accordingly. A voluntary wheel-running system measured changes in circadian running activity after 4 and 15 weeks of ID diet. Protein analysis was performed on the entire midbrain region from the 15 week ID and control WT mouse groups. Screening for proteins that show changes during iron-deficiency was performed by two dimension fluorescence difference in gel electrophoresis (2-D DIGE). Afterwards, proteins were identified using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) followed by quantitative Western blotting and 2-D isoelectic focussing followed by SDS-PAGE (2-D IEF/SDS-PAGE).1) The acute pain response was elevated in ID WT mice after 4 and 15 weeks. After 15 weeks of diet, D3-/- mice exhibit an increased acute pain response compared to WT mice. Iron-deficiency did not further heighten the acute pain response in D3-/- mice.2) The persistent pain response was increased in ID WT mice after all durations of ID diet (1, 4 and/or 15 weeks). After 15 weeks of diet, D3-/- mice showed an elevated pain response which was further increased by iron-deficiency.3) After 15 weeks of ID diet, an increased running activity (number of runs and activity time) was shown in ID WT mice specifically 2 hours before the end of the active dark phase (06:00hr-07:00hr). ID D3-/- mice showed a heightened running activity at an earlier time period (03:00hr-04:00hr).4) In total 14 protein targets were dysregulated, 5 of which were identified by MALDI-TOF-MS. One of these proteins was sirtuin 2 (SIRT2), where its expression was elevated by 20% in ID WT mice. Quantitative Western blotting and 2-D IEF/SDS-PAGE identified non-significant changes, however all techniques confirm a similar increase in SIRT2 protein expression at the short SIRT2 variant 2 (v2) localised predominantly in myelin. Isoform 2 of SIRT v2 which has an unknown function shows this increase. Proteolipid protein/DM20 (PLP/DM20) and dopamine transporter (DAT) show similar trends to that previously described in other ID rodent studies.The work reported in this thesis has identified iron-deficiency as a factor in increasing both the sensory perception and modifying the circadian onset of increased motor activity. The pain tests show increased acute and persistent inflammatory pain responses, in addition to an elevated motor activity and activity time prior to the sleep phase in mice, corresponding to a period showing increased RLS complaints in humans. In the absence of D3 receptors, iron-deficiency has a synergistic role in shifting the onset of heightened activity to an earlier onset by at least 2 hours, which is characteristic of augmentation described in human RLS under dopaminergic therapy. These behavioural tests have proved effective in describing both sensory and motor changes which are comparable to those in RLS patients. Moreover, this is the first animal model which shows the closest match to RLS symptoms. In addition to the behavioural studies, the identification of SIRT2 in relation to iron-deficiency by using MALDI-TOF-MS is a novel finding. To date there is no animal model based on the genetic variants identified. Therefore, investigating changes caused by iron-deficiency in the mouse compared to the rat due to its fully identified genome, offers the most promising approach. Findings from these mouse studies will prove important in the future by contributing to the design of a genetic mouse model of RLS.
Keywords: Iron-deficiency; Restless legs syndrome; Animal behaviour; Protein expression; Male mouse
Weitere Sprachen
Das Restless-Legs-Syndrom (RLS) bzw. Syndrom der
ruhelosen Beine ist eine häufig auftretende
neurologische Krankheit. RLS-Patienten leiden an
beinbetonten teilweise schmerzhaften Mißempfindungen
und Bewegungsdrang. Man unterscheidet zwischen einem
idiopathischen oder primären und einem sekundären RLS.
Während die idiopathische Form genetische Ursachen hat,
sind für die sekundäre Form erworbene Krankheiten oder
Mangelerscheinungen verantwortlich. Die Symptome bei
RLS werden auf eine Störung des dopaminergen Systems
zurückgeführt und werden entsprechend mit
Dopaminagonisten behandelt. Seit einiger Zeit ist Eisen
in den Fokus der RLS-Forschung getreten. Eisen spielt
eine Rolle als Ko-Faktor bei der Regulation von
Tyrosin-Hydroxylase und Dopamintransporter, zwei
wichtigen Komponenten im Dopaminergen System. Eine
Vielzahl von Daten weist auf eine kausale Ursache von
Eisenmangel für das Restless-Legs-Syndrom hin. Im
Mittelpunkt dieser Arbeit steht der Einfluss von
Eisenmangel auf das sensible und motorische
Nervensystem und die Etablierung eines Tiermodells für
das sekundäre Restless-Legs-Syndrom. Die Untersuchungen
umfassen Verhaltensanalyse, Immunhistologie und
Proteinexpressionsanalyse.Um bei männlichen C57Bl/6 Wildtyp-Mäusen (WT) und
Dopaminrezeptor 3 Knock-out-Mäusen (D3-/-) einen
Eisenmangel auszulösen, erhielten die Tiere in den
ersten 28 Tagen nach Geburt ausschließlich eisenfreies
Tierfutter. Einzelne Gruppen wurden der eisenfreien
Diät für 1, 4, 8, 15 oder 30 Wochen unterzogen. Zu
unterschiedlichen Zeitpunkten wurde dann die sensible
Verhaltenskomponente mittels Hot-Plate-Test und
Formalin-Test untersucht. Beim Hot-Plate-Test werden so
genannte Aδ-Fasern stimuliert, die für kurzzeitige
Schmerzweiterleitungen verantwortlich sind. Der
Formalin-Test hingegen löst beim Versuchstier einen
lang anhaltenden Schmerzvorgang via C-Fasern aus.
Klinische Studien haben gezeigt, dass sowohl die
Aktivierung von Aδ- als auch afferente C-Fasern bei
RLS-Patienten verändert ist. Im Anschluss an die
Verhaltensexperimente folgten Immunhistologische
Untersuchungen der Schmerzeffekte auf Rückenmarksebene.
Bei RLS treten die Symptome hauptsächlich in den
Ruhephasen auf. Dabei verschafft vermehrte
Körperbewegung Milderung der Symptome, was den
Bewegungsdrang der Patienten erklärt. Mithilfe von
Laufradexperimenten sollte die Frage geklärt werden, ob
eine ähnliche motorische Verhaltenskomponente auch bei
an Eisenmangel leidenden Mäusen festzustellen ist.
Dafür wurde die tageszeitabhängige (zirkardiane),
selbstgenerierte motorische Aktivität über mehrere
Wochen erfasst. Mögliche Einflüsse von Eisenmangel auf
die Proteinexpression wurden mittels
Fluoreszenz-2D-Differentialgelelektrophorese (2-D DIGE)
untersucht. Im Anschluss wurden die Proteine mithilfe
von Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) identifiziert
und unter Anwendung der Western-Blot-Analyse und
SDS-PAGE (2-D IEF/SDS-PAGE) quantifiziert.1) Im Vergleich zur Kontrollgruppe, führte 4 und 15
Wochen eisenfreie Kost zu einer Verstärkung der akuten
Schmerzwahrnehmung bei Wildtypmäusen. Nach 15 Wochen
eisenfreier Diät zeigten D3-/--Knock-out-Mäuse eine
erhöhte, akute Schmerzwahrnehmung im Vergleich zu
Wildtyp-Mäusen. Im Vergleich mit normal ernährten
D3-/--Knock-out-Mäusen konnte jedoch gezeigt werden,
dass Eisenmangel die Schmerzempfindlichkeit der
transgenen Tiere nicht weiter verstärkt. Der
längerfristige, Formalin-induzierte Schmerzreiz führte
bei Wildtypmäusen zu einer verstärkten Schmerzreaktion
schon nach einer Woche eisenfreier Diät.
D3-/--Knock-out-Mäuse wiesen hingegen erst nach 15
Wochen eine Verstärkung der Schmerzwahrnehmung auf, die
durch Eisenmangel weiter verstärkt wurde.2) Untersuchungen der zirkadianen Laufradaktivität
konnten zeigen, dass Eisenmangel nach 15 Wochen zu
einer Erhöhung der Laufleistung führt. Diese Erhöhung
trat vor allem 2 Stunden vor Beginn der Ruhephase (ca.
06:00 - 07:00 Uhr), unter gleichen Bedingungen bei
D3-/--Knock-out-Mäusen bereits früher auf (03:00 -
04:00 Uhr) auf.3) Insgesamt fanden sich bei 14 Proteinen auf
Eisenmangel zurückzuführende Unterschiede in der
Proteinexpression. 5 von ihnen wurden mittels
Massenspektrometrie identifiziert. Eines dieser
Proteine, Sirtuin 2 (SIRT2), wies eine Erhöhung der
Proteinexpression von insgesamt 20% auf. Dieses
Ergebnis wurde durch quantitative Western-Blot-Analyse
und 2-D IEF/SDS-PAGE bestätigt. Jedoch sind die
Unterschiede nicht statistisch signifikant. Weniger
stark ausgeprägte Unterschiede fanden sich bei den
Proteinen Sirtuin 2 Variante 2 (SIRT2v2) und dessen
Isoform, Proteolipidprotein/DM20 (PLP/DM20) und
Dopamintransporter (DAT). Der Einfluss von Eisenmangel
auf PLP/DM20 und DAT ist in der Literatur weitgehend
bekannt. Die Funktion von SIRT2 und der
Myelin-assoziierten Variante SIRT2v2 ist bisher
unbekannt.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine deutliche
Beeinträchtigung des sensiblen und motorischen
Nervensystems durch Eisenmangel mit erhöhter
Schmerzempfindlichkeit bzw. Schmerzwahrnehmung. Die
Verschiebung der zirkardianen Laufaktivität, verstärkt
bei Dopaminrezeptor 3 Knock-out-Mäusen, lassen sich gut
mit den in der Ruhephase auftretenden Schmerzen und
Bewegungsdrang bei RLS vergleichen. Weiterhin
verdeutlichen diese Ergebnisse die Bedeutung von Eisen
für das dopaminerge System und das
Restless-Legs-Syndrom sowie die Wirksamkeit der
Dopaminagonisten-Therapie. Reproduzierbarkeit und
vergleichbare Symptomatik beim Menschen legen die
Verwendung dieses Tiermodells des Restless-Legs-Syndrom
auch für die Zukunft nahe wobei die Identifizierung von
SIRT2 und SIRTv2 und deren Verbindung mit Eisenmangel
größerer Tierzahlen erfordert. Bis heute mangelt es an
einem geeigneten Tiermodell für die primäre, erblich
bedingte Form von RLS, wobei eine weitere Nutzung der
hier gezeigten Teste in einem genetischen Tiermodell
der Maus avisiert ist.
Schlagwörter: Eisenmangel; Restless-Legs-Syndrom; Verhaltensanalyse; Proteinexpression; männliche Labormaus