Impact of iron-deficiency upon behaviour and protein expression in the male mouse with implications for Restless Legs Syndrome

Abstract

Das Restless-Legs-Syndrom (RLS) bzw. Syndrom der ruhelosen Beine ist eine häufig auftretende neurologische Krankheit. RLS-Patienten leiden an beinbetonten teilweise schmerzhaften Mißempfindungen und Bewegungsdrang. Man unterscheidet zwischen einem idiopathischen oder primären und einem sekundären RLS. Während die idiopathische Form genetische Ursachen hat, sind für die sekundäre Form erworbene Krankheiten oder Mangelerscheinungen verantwortlich. Die Symptome bei RLS werden auf eine Störung des dopaminergen Systems zurückgeführt und werden entsprechend mit Dopaminagonisten behandelt. Seit einiger Zeit ist Eisen in den Fokus der RLS-Forschung getreten. Eisen spielt eine Rolle als Ko-Faktor bei der Regulation von Tyrosin-Hydroxylase und Dopamintransporter, zwei wichtigen Komponenten im Dopaminergen System. Eine Vielzahl von Daten weist auf eine kausale Ursache von Eisenmangel für das Restless-Legs-Syndrom hin. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht der Einfluss von Eisenmangel auf das sensible und motorische Nervensystem und die Etablierung eines Tiermodells für das sekundäre Restless-Legs-Syndrom. Die Untersuchungen umfassen Verhaltensanalyse, Immunhistologie und Proteinexpressionsanalyse.Um bei männlichen C57Bl/6 Wildtyp-Mäusen (WT) und Dopaminrezeptor 3 Knock-out-Mäusen (D3-/-) einen Eisenmangel auszulösen, erhielten die Tiere in den ersten 28 Tagen nach Geburt ausschließlich eisenfreies Tierfutter. Einzelne Gruppen wurden der eisenfreien Diät für 1, 4, 8, 15 oder 30 Wochen unterzogen. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurde dann die sensible Verhaltenskomponente mittels Hot-Plate-Test und Formalin-Test untersucht. Beim Hot-Plate-Test werden so genannte Aδ-Fasern stimuliert, die für kurzzeitige Schmerzweiterleitungen verantwortlich sind. Der Formalin-Test hingegen löst beim Versuchstier einen lang anhaltenden Schmerzvorgang via C-Fasern aus. Klinische Studien haben gezeigt, dass sowohl die Aktivierung von Aδ- als auch afferente C-Fasern bei RLS-Patienten verändert ist. Im Anschluss an die Verhaltensexperimente folgten Immunhistologische Untersuchungen der Schmerzeffekte auf Rückenmarksebene. Bei RLS treten die Symptome hauptsächlich in den Ruhephasen auf. Dabei verschafft vermehrte Körperbewegung Milderung der Symptome, was den Bewegungsdrang der Patienten erklärt. Mithilfe von Laufradexperimenten sollte die Frage geklärt werden, ob eine ähnliche motorische Verhaltenskomponente auch bei an Eisenmangel leidenden Mäusen festzustellen ist. Dafür wurde die tageszeitabhängige (zirkardiane), selbstgenerierte motorische Aktivität über mehrere Wochen erfasst. Mögliche Einflüsse von Eisenmangel auf die Proteinexpression wurden mittels Fluoreszenz-2D-Differentialgelelektrophorese (2-D DIGE) untersucht. Im Anschluss wurden die Proteine mithilfe von Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) identifiziert und unter Anwendung der Western-Blot-Analyse und SDS-PAGE (2-D IEF/SDS-PAGE) quantifiziert.1) Im Vergleich zur Kontrollgruppe, führte 4 und 15 Wochen eisenfreie Kost zu einer Verstärkung der akuten Schmerzwahrnehmung bei Wildtypmäusen. Nach 15 Wochen eisenfreier Diät zeigten D3-/--Knock-out-Mäuse eine erhöhte, akute Schmerzwahrnehmung im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Im Vergleich mit normal ernährten D3-/--Knock-out-Mäusen konnte jedoch gezeigt werden, dass Eisenmangel die Schmerzempfindlichkeit der transgenen Tiere nicht weiter verstärkt. Der längerfristige, Formalin-induzierte Schmerzreiz führte bei Wildtypmäusen zu einer verstärkten Schmerzreaktion schon nach einer Woche eisenfreier Diät. D3-/--Knock-out-Mäuse wiesen hingegen erst nach 15 Wochen eine Verstärkung der Schmerzwahrnehmung auf, die durch Eisenmangel weiter verstärkt wurde.2) Untersuchungen der zirkadianen Laufradaktivität konnten zeigen, dass Eisenmangel nach 15 Wochen zu einer Erhöhung der Laufleistung führt. Diese Erhöhung trat vor allem 2 Stunden vor Beginn der Ruhephase (ca. 06:00 - 07:00 Uhr), unter gleichen Bedingungen bei D3-/--Knock-out-Mäusen bereits früher auf (03:00 - 04:00 Uhr) auf.3) Insgesamt fanden sich bei 14 Proteinen auf Eisenmangel zurückzuführende Unterschiede in der Proteinexpression. 5 von ihnen wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Eines dieser Proteine, Sirtuin 2 (SIRT2), wies eine Erhöhung der Proteinexpression von insgesamt 20% auf. Dieses Ergebnis wurde durch quantitative Western-Blot-Analyse und 2-D IEF/SDS-PAGE bestätigt. Jedoch sind die Unterschiede nicht statistisch signifikant. Weniger stark ausgeprägte Unterschiede fanden sich bei den Proteinen Sirtuin 2 Variante 2 (SIRT2v2) und dessen Isoform, Proteolipidprotein/DM20 (PLP/DM20) und Dopamintransporter (DAT). Der Einfluss von Eisenmangel auf PLP/DM20 und DAT ist in der Literatur weitgehend bekannt. Die Funktion von SIRT2 und der Myelin-assoziierten Variante SIRT2v2 ist bisher unbekannt.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine deutliche Beeinträchtigung des sensiblen und motorischen Nervensystems durch Eisenmangel mit erhöhter Schmerzempfindlichkeit bzw. Schmerzwahrnehmung. Die Verschiebung der zirkardianen Laufaktivität, verstärkt bei Dopaminrezeptor 3 Knock-out-Mäusen, lassen sich gut mit den in der Ruhephase auftretenden Schmerzen und Bewegungsdrang bei RLS vergleichen. Weiterhin verdeutlichen diese Ergebnisse die Bedeutung von Eisen für das dopaminerge System und das Restless-Legs-Syndrom sowie die Wirksamkeit der Dopaminagonisten-Therapie. Reproduzierbarkeit und vergleichbare Symptomatik beim Menschen legen die Verwendung dieses Tiermodells des Restless-Legs-Syndrom auch für die Zukunft nahe wobei die Identifizierung von SIRT2 und SIRTv2 und deren Verbindung mit Eisenmangel größerer Tierzahlen erfordert. Bis heute mangelt es an einem geeigneten Tiermodell für die primäre, erblich bedingte Form von RLS, wobei eine weitere Nutzung der hier gezeigten Teste in einem genetischen Tiermodell der Maus avisiert ist.