Proteomanalyse lysosomaler Membranen: Identifizierung und Charakterisierung neuer lysosomaler Membranproteine
Proteome analysis of the lysosomal membrane: identification and characterization of novel lysosomal membrane proteins
von Oliver Schieweck
Datum der mündl. Prüfung:2008-07-02
Erschienen:2009-06-18
Betreuer:Prof. Dr. Dr. h.c. Kurt von Figura
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Ficner
Gutachter:PD Dr. Michael Hoppert
Gutachter:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Lysosomes are intracellullar acidic vesicles, which contain a variety of soluble and membrane-bound proteins like hydrolases and transport-systems. They are found in all nucleated eukaryotic cells where they are responsible for degradation and recycling of cellular macromolecules. The lysosomal matrix contains at least fifty hydrolases like proteases, nucleases, glycosidases, sulfatases und lipases. In the lysosomal membrane a lot of transport-systems care for the export of various products of the lysosomal degradation or for the import of protons maintaining the acidic pH, whereas receptor proteins are part of protein-sorting systems. A number of gene defects of lysosomal membrane proteins are known to lead to lysosomal storage diseases like the different versions of the ceroid neuronal lipofuscinosis (CNL). Since the presence of most of the lysosomal membrane-integrated proteins are only predicted, based on biochemical studies, but not identified so far, the aim of this study was to identify new lysosomal membrane proteins by a proteomic approach. For this purpose, lysosomes from mouse liver treated with the detergent tyloxapol (triton WR 1339) were isolated. These lysosomes, called tritosomes, are of low density due to their loading with detergent and could therefore be separated easily from other cell organelles by centrifugation. After disruption of the vesicles by sonication and washing with sodium carbonate, the tritosomal membrane proteins were isolated using different PAGE-Systems, deglycosylated to remove oligosaccharide side chains and in gel-digested with trypsin. The peptides were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry generating peptide mass fingerprints (PMF) and post source decay (PSD) fragment spectra, and the mass data were used to identify the corresponding proteins in mouse protein databases. In total, 193 different proteins could be identified. A bioinformatic examination revealed that thirteen of them contain a signal sequence and at least one transmembrane domain, making them candidates for a localization in the lysosomal membrane. Two of these candidates, the hypothetical protein Loc72175 and the protein NCU-G1 (the latter has been identified in cooperation with the group of Prof. Andrej Hasilik, Institut für Physiologische Chemie, Marburg), were cloned and expressed recombinantly in eukaryotic cell lines (HeLa, HT1080, MEF). Loc 72175 is a type-3 membrane protein and a member of the major facilitator superfamily, NCU-G1 a type-1 membrane protein. Both proteins could be found to colocalize with the lysosomal membrane protein Lamp-2, but not with marker proteins for other cellular compartments like ER, Golgi and early endosomes. For both proteins, lysosomal sorting motives of the tyrosin- and dicleucin-type were found and proved to be essential for targeting the proteins to the lysosomes.
Keywords: lysosomes; lysosomal membrane proteins; proteom analysis; NCU G1; MFSd8; lysosomal localization
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Lysosomen sind intrazelluläre vesikuläre
Kompartimente, die begrenzt von einer Membran und
definiert durch ein saures Milieu eine Vielzahl
verschiedener löslicher und Membran-gebundener Proteine
wie Hydrolasen und Transportsysteme enthalten. Sie
existieren in allen kernhaltigen eukaryotischen
Zelltypen und sind vor allem für die Degradation und
das Recycling aller zellulären Makromoleküle
verantwortlich. Die lysosomale Matrix enthält
wahrscheinlich mehr als fünfzig verschiedene Hydrolasen
wie Proteasen, Nukleasen, Glykosidasen, Sulfatasen und
Lipasen, während die lysosomale Membran viele
Transportsysteme zum Export der verschiedenen durch die
Abbauvorgänge entstehenden Abbauprodukte, zum Import
von Protonen zur Erhaltung des sauren pH und
Rezeptorproteine für die verschiedenen
Protein-Sortierungsvorgänge enthält. Viele Defekte
lysosomaler Membranproteine führen zu lysosomalen
Speicherkrankheiten, wie zum Beispiel die verschiedenen
Formen der ceroiden neuronalen Lipofuscinose (CNL). Da
davon ausgegangen werden kann, dass der Großteil der in
der lysosomalen Membran integrierten Proteine noch
nicht identifiziert wurde, war das Ziel dieser Arbeit,
neue lysosomale Membranproteine durch eine
Proteomics-Analyse zu identifizieren und anschließend
die lysosomale Lokalisation durch Immunfluoreszenz zu
überprüfen. Hierfür wurde die Leber von Mäusen
präpariert, die mit dem Detergens Tyloxapol (Triton
WR1339) behandelt waren. Die durch den Einbau des
Detergens in die Lysosomen gebildeten Tritosomen
niedriger Dichte ließen sich durch verschiedene
Zentrifugationsschritte zum großen Teil von den anderen
Zellorganellen abtrennen. Nach Öffnung der Tritosomen
und Reinigung der tritosomalen Membran durch Behandlung
mit Natriumcarbonat wurden die Membranproteine durch
die Verwendung verschiedener PAGE-Systeme gereinigt,
deglykosyliert um störende Zuckermodifikationen der
Proteine zu entfernen und nach In-Gel-Verdau mit
Trypsin mit MALDI-TOF-MS und -MS/MS analysiert. Dadurch
wurden insgesamt 193 verschiedene Proteine
identifiziert, von denen nach einer bioinformatischen
Untersuchung 13 als Kandidaten für eine Lokalisation in
der lysosomalen Membran eingestuft wurden. Von diesen
Kandidaten wurde das Protein mit dem Namen
hypothetisches Protein Loc72175 und ein weiteres
Protein (NCU-G1), das in einer Kooperation mit der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Andrej Hasilik
identifiziert wurde, kloniert und rekombinant in den
eukaryotischen Zelllinien HeLa, HT1080 und MEF
exprimiert. Bei dem Loc72175-Protein handelt es sich um
ein Typ-3-Membranprotein, welches der MFS
Proteinfamilie zugeordnet werden kann, während es sich
bei dem NCU-G1 um ein Typ-1-Membranprotein handelt. Für
beide Proteine konnte eine lysosomale Lokalisation
durch die Kolokalisation mit dem lysosomalen
Markerprotein Lamp-2 bestätigt werden, während in
Versuchen mit anderen Markerproteinen eine Lokalisation
in anderen intrazellulären Komparimenten wie dem ER,
Golgi und den frühen Endosomen nicht gezeigt werden
konnte. Darüber hinaus wurden terminale lysososomale
Sortierungsmotive vom Tyrosin- und vom
Dileucin-basierten Typ in beiden Proteinen auf ihre
Bedeutung bei der intrazellulären Sortierung zu den
Lysosomen untersucht, indem kritische Aminosäuren
innerhalb dieser Sequenzen mutiert wurden. Dabei zeigte
sich, dass alle der hier untersuchten Motive für eine
Sortierung in die Lysosomen essentiell sind.
Schlagwörter: Lysosomen; lysosomale Membranproteine; Proteomanalyse; NCU G1; MFSd8; lysosomale Lokalisation