Proteomanalyse lysosomaler Membranen: Identifizierung und Charakterisierung neuer lysosomaler Membranproteine

Abstract

Lysosomen sind intrazelluläre vesikuläre Kompartimente, die begrenzt von einer Membran und definiert durch ein saures Milieu eine Vielzahl verschiedener löslicher und Membran-gebundener Proteine wie Hydrolasen und Transportsysteme enthalten. Sie existieren in allen kernhaltigen eukaryotischen Zelltypen und sind vor allem für die Degradation und das Recycling aller zellulären Makromoleküle verantwortlich. Die lysosomale Matrix enthält wahrscheinlich mehr als fünfzig verschiedene Hydrolasen wie Proteasen, Nukleasen, Glykosidasen, Sulfatasen und Lipasen, während die lysosomale Membran viele Transportsysteme zum Export der verschiedenen durch die Abbauvorgänge entstehenden Abbauprodukte, zum Import von Protonen zur Erhaltung des sauren pH und Rezeptorproteine für die verschiedenen Protein-Sortierungsvorgänge enthält. Viele Defekte lysosomaler Membranproteine führen zu lysosomalen Speicherkrankheiten, wie zum Beispiel die verschiedenen Formen der ceroiden neuronalen Lipofuscinose (CNL). Da davon ausgegangen werden kann, dass der Großteil der in der lysosomalen Membran integrierten Proteine noch nicht identifiziert wurde, war das Ziel dieser Arbeit, neue lysosomale Membranproteine durch eine Proteomics-Analyse zu identifizieren und anschließend die lysosomale Lokalisation durch Immunfluoreszenz zu überprüfen. Hierfür wurde die Leber von Mäusen präpariert, die mit dem Detergens Tyloxapol (Triton WR1339) behandelt waren. Die durch den Einbau des Detergens in die Lysosomen gebildeten Tritosomen niedriger Dichte ließen sich durch verschiedene Zentrifugationsschritte zum großen Teil von den anderen Zellorganellen abtrennen. Nach Öffnung der Tritosomen und Reinigung der tritosomalen Membran durch Behandlung mit Natriumcarbonat wurden die Membranproteine durch die Verwendung verschiedener PAGE-Systeme gereinigt, deglykosyliert um störende Zuckermodifikationen der Proteine zu entfernen und nach In-Gel-Verdau mit Trypsin mit MALDI-TOF-MS und -MS/MS analysiert. Dadurch wurden insgesamt 193 verschiedene Proteine identifiziert, von denen nach einer bioinformatischen Untersuchung 13 als Kandidaten für eine Lokalisation in der lysosomalen Membran eingestuft wurden. Von diesen Kandidaten wurde das Protein mit dem Namen hypothetisches Protein Loc72175 und ein weiteres Protein (NCU-G1), das in einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Andrej Hasilik identifiziert wurde, kloniert und rekombinant in den eukaryotischen Zelllinien HeLa, HT1080 und MEF exprimiert. Bei dem Loc72175-Protein handelt es sich um ein Typ-3-Membranprotein, welches der MFS Proteinfamilie zugeordnet werden kann, während es sich bei dem NCU-G1 um ein Typ-1-Membranprotein handelt. Für beide Proteine konnte eine lysosomale Lokalisation durch die Kolokalisation mit dem lysosomalen Markerprotein Lamp-2 bestätigt werden, während in Versuchen mit anderen Markerproteinen eine Lokalisation in anderen intrazellulären Komparimenten wie dem ER, Golgi und den frühen Endosomen nicht gezeigt werden konnte. Darüber hinaus wurden terminale lysososomale Sortierungsmotive vom Tyrosin- und vom Dileucin-basierten Typ in beiden Proteinen auf ihre Bedeutung bei der intrazellulären Sortierung zu den Lysosomen untersucht, indem kritische Aminosäuren innerhalb dieser Sequenzen mutiert wurden. Dabei zeigte sich, dass alle der hier untersuchten Motive für eine Sortierung in die Lysosomen essentiell sind.