Vergleichende Untersuchungen zur Regulation der SNARE-Komplexbildung durch Sec1/Munc18-Proteine

Abstract

Membranfusionsereignisse zwischen den verschiedenen Kompartimenten eukaryotischer Zellen werden durch zwei konservierte Proteinfamilien vermittelt: SNARE- und Sec1/Munc18 (SM)-Proteine. Die SNARE-Proteine Syntaxin1a, SNAP-25 und Synaptobrevin2 sind in Nervenzellen an der Fusion synaptischer Vesikel mit der Plasmamembran beteiligt. Syntaxin1a und SNAP-25 sind auf der Plasmamembran lokalisiert, Synaptobrevin2 auf der Vesikelmembran. Die Komplexbildung der drei Membranproteine zwischen Plasma- und Vesikelmembran leitet die Fusion ein. SM-Proteine interagieren mit SNARE-Proteinen, allerdings ist der genaue molekulare Mechanismus dieser Interaktion noch nicht wirklich aufgeklärt. So bindet das SM-Protein Munc18a fast die gesamte zytosolische Domäne von Syntaxin1a in der so genannten geschlossenen Konformation. Mehrere andere SM-Proteine (i.e. Munc18c, Sly1, Vps45) scheinen dagegen nur ein kurzes N-terminales Peptid für die Bindung an ihren Syntaxinpartner zu verwenden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte ich mittels ITC zeigen, dass für eine hochaffine Bindung von Munc18a und Syntaxin1a nicht nur Kontakte von der geschlossenen Konformation, sondern zusätzlich Kontakte vom N-terminalen Peptid von Syntaxin1a nötig sind. In der Tat konnte das N-terminale Peptid in eine zuvor übersehene Elektronendichte in der Kristallstruktur eingefügt werden. Diese befindet sich an der äußeren Oberfläche der Domäne 1 von Munc18a. Die Elektronendichte konnte verfeinert werden und die Aminosäuren 2-9 vom N-terminalen Syntaxin1a-Peptid in die Elektronendichte eingebaut werden. Des Weiteren wurde ein zweites SM-Protein/Syntaxin-Paar untersucht. Auch für eine hochaffine Interaktion von Vps45 und Syntaxin16 ist das N-terminale Peptid und der gesamte Rest des Syntaxin16-Moleküls, sehr wahrscheinlich in einer geschlossenen Konformation, an der Bindung beteiligt. Meine Arbeit zeigt, dass SM-Protein/Syntaxin-Paare über einen konservierten Bindungsmechanismus interagieren. An der kooperativen Bindung scheinen jeweils zwei Bereiche von Syntaxin1a beteiligt. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde der Einfluss von Munc18a auf die SNARE-Komplexbildung untersucht. Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass Munc18a Syntaxin1a bindet und die SNARE-Komplexbildung in vitro blockiert. Bisher konnte allerdings nicht geklärt werden, wie Syntaxin1a sich aus der festen Umklammerung von Munc18a befreien kann. In der hier vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von Munc18a mit dem N-Peptid nötig ist, um die SNARE-Komplexbildung unterbinden zu können. Wurde das N-terminale Peptid von Syntaxin1a entfernt oder die Bindung durch Punktmutationen im N-terminalen Peptid bzw. in der Munc18a-Bindestelle gestört, war die SNARE-Komplexbildung in Anwesenheit von Munc18a nicht mehr blockiert. Dieser Befund weist auf einen möglichen Konformationswechsel im Munc18a/Syntaxin1a-Komplex hin. Abschließend wurde die Interaktion von Munc18 und Syntaxin1 und die Rolle von Munc18 bei der SNARE-Komplexbildung in dem Choanoflagellaten Monosiga brevicollis, einem den Tieren nahe verwandter Einzeller, untersucht. Es stellte sich heraus, dass nicht nur die Bindung von Munc18 an das N-terminale Peptid und die geschlossene Konformation von Syntaxin1 in Choanoflagellaten hoch konserviert ist, sondern auch die regulative Funktion von Munc18 bei der SNARE-Komplexbildung. Des Weiteren legen meine licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen nahe, dass Monosiga brevicollis einen Sekretionsapparat besitzt, welcher sich in der apikalen Region der Zelle befindet.