Investigation of Protein Structure and Dynamics

Abstract

Teil I beschreibt strukturelle Untersuchungen an einem Calmodulin-Peptid-Komplex mittels NMR Spektroskopie. Der intrazelluläre Calciumsensor Calmodulin, ein Modellsystem für Zwei-Domänen-Proteine, kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Peptiden wechselwirken, darunter auch das IQ-Motiv im cytoplasmischen Teil der CaV 1 Untereinheit von spannungsregulierten Ionenkanälen. Eine Kristallstruktur des CaM/IQ-Komplexes konnte zeigen, dass die N-terminale Domäne zwei unterschiedliche Konformationen einnehmen kann, was wiederum auf konformationelle Plastizität hindeuted. Um diese Plastizität zu untersuchen, und um Bewegungsmodelle der zugrunde liegenden Prozesse zu entwickeln, wurde das sogenannte Paramagnetische Alignment genutzt, um Domänendynamik mittels des RDC NMR Parameters zu untersuchen. Die Ergebnisse werden mit den vorhandenen Strukturen des Komplexes verglichen. Aus den Daten wird geschlossen, dass in Lösung mehr Bewegung vorhanden ist, als in den vorhandenen Strukturen, welche wahrscheinlich nur ein Subset der möglichen Konformationen darstellen.Teil II befasst sich mit der Entwicklung einer Web-Anwendung die bei der Identifizierung von Protein-Protein Crosslinks und Protein Post-translationalen Modifikationen behilflich sein kann. Obwohl mehrere etablierte Softwarepakete auf dem Markt sind (z.B. Mascot, Sequest), sind diese nicht geeignet um diverse Szenarien abzudecken, die durch die jüngsten Entwicklungen offen gelegt wurden. Dies betriff insbesondere grosse peptid-basierte Modifikationen. Diese Modifikationen beinhalten post-translationale Modifikationen, z.B. durch Ubiquitin und Ubiquitin-like modifiers (Ubl), als auch Protein-Protein Crosslinks. Solche Verbindungen können endogener Natur sein, z.B. Disulfidbrücken, oder experimentell induziert durch chemische Reagenzien, um die dreidimensionale Struktur von, oder die Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu untersuchen. Im Gegensatz zu bestehenen Programme zur Analyse dieser Daten, ist das hier vorgestellte Paket ChopTools nicht auf bestimmte Modifikationen beschränkt. Es wird ein effizienter Mechanismus zur Verfügung gestellt um umfassende Peptid- und Massenbibliotheken zu erstellen. Hierdurch kann die Kluft zwischen bestehenden Analyseschemata und neuen experimentellen Methoden überwunden und beide Ansätze kombiniert werden.Teil III befasst sich mit Untersuchungen der dreidimensionalen Struktur des Dead End Proteins. Dieses Protein spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Keimzellen im Modellorganismus Zebrafisch. Hinzu ist bekannt, dass eine bestimmte Mutation dieses Genes in der Maus zum Verlust der Keimzellen und der Bildung von Hodenkrebs führt. Verwandte Homologe des Genes sind auch im Krallenfrosch, Huhn und Mensch bekannt. Primarsequenzanalysen und funktionelle Studien deuten auf eine essentielle Kernregion hin, die eine RNA bindende Domäne enthält, und eine weitere Domäne von unbekannter Struktur. Eine Vielzahl von Proteinexpressions- und Aufreinigungsstrategien werden im Kontext des Dead End Proteins diskutiert. Obwohl keine Strukturuntersuchung stattfinden konnte, so wurde die Grundlage für zukünftige biophysikalische und biochemische Untersuchungen dieses Proteins geschaffen.