Live Cell STED Microscopy using Genetically Encoded Markers
Lebendzell-STED-Mikroskopie mit genetisch kodierten Markierungen
von Birka Hein
Datum der mündl. Prüfung:2009-07-02
Erschienen:2009-08-05
Betreuer:Prof. Dr. Stefan Hell
Gutachter:Prof. Dr. Jürgen Troe
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Hell
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Far-field fluorescence microscopy is a tool of outstanding importance in the biological sciences, due to its non-invasiveness especially for the investigation of living cells, tissue and animals. Today also the major drawback in light microscopy, namely its limited resolution, has been overcome by utilizing photoswitching between different states of the fluorophore. STimulated Emission Depletion (STED) microscopy was the first farfield fluoresence nanoscopy approach to evolve, offering images with a resolution far beyond the diffraction barrier. However, until now STED microscopy was mostly confined to imaging fixed and therefore dead samples, because immunocytochemistry, the method of choice for fluorescence labeling for STED microscopy, requires in most cases the permeabilization and therefore fixation of the specimen. In this work, STED microscopy in living cells has been established. Two different labeling approaches have been applied: By using derivatives of green fluorescent protein (GFP), which is widely used in conventional live cell imaging, a resolution of 50 nm in the lateral and 150 nm in the axial direction within living cells is achieved. Alternatively, genetically encoded tagging proteins capable of binding modified organic dyes are employed. Structures as small as 40 nm can be discerned in living cells by this method. Both approaches also allow for watching structural changes on the nanoscale within the cell by taking time-lapse image series, as shown in various examples in this work. To monitor even faster processes on the nanoscale, STED fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is applied in conjunction with these labeling approaches, elucidating nanoscopic details of the dynamics of membraneanchored proteins not observable with conventional confocal FCS. By utilizing these results, many ongoing fluorescence microscopy studies in living cells, which are currently performed with a diffraction-limited confocal microscope, can be carried out with a substantially improved spatial resolution in all directions by means of STED microscopy. Altogether, this paves the way for new insights into a bustling nanocosmos.
Keywords: STED; GFP; Fluorescence; Live Cell Microscopy
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Die Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist ein
Untersuchungsverfahren von herausragender Bedeutung in
den modernen Biowissenschaften. Als nichtinvasive,
berührungsfreie Methode wird sie besonders zur
Untersuchung lebender Proben eingesetzt. Heutzutage ist
auch der größte Nachteil der Lichtmikroskopie, nämlich
ihr begrenztes Auflösungsvermögen, beseitigt, indem
durch Licht zwischen verschiedenen Zuständen des
Farbstoffes hin- und hergeschaltet wird. Die STimulated
Emission Depletion (STED) Mikroskopie war die erste
praktisch umgesetzte Fernfeld-Methode, die in Bildern
mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze
resultierte. Bisher war die STED-Mikroskopie allerdings
allgemein auf die Untersuchung fixierter und somit
toter Proben beschränkt, weil das benutzte
Färbeverfähren, die Immunohistochemie, in den meisten
Fällen Permeabilisierung und damit auch Fixierung der
Probe voraussetzt. In dieser Arbeit wurde die STED
Mikroskopie in lebenden Proben etabliert. Dazu wurden
zwei verschiedene Färbeansätze genutzt: Mit
Abkömmlingen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP),
welches vielfach in herkömmlicher
Lebendzell-Mikroskopie Verwendung findet, wurde eine
Auflösung von 50 nm in der lateralen und 150 nm in der
axialen Richtung in lebenden Zellen erreicht. Außerdem
wurden genetisch kodierte Markierungsproteine genutzt,
die modifizierte organische Farbstoffe binden können.
Auf diese Weise wurden Details von bis zu 40 nm in
lebenden Zellen aufgelöst. Beide Methoden erlauben
außerdem das Aufnehmen von nanoskopischen Videos, in
denen strukturelle Veränderungen beobachtet werden, wie
in dieser Arbeit anhand von mehreren Beispielen gezeigt
wurde. Um noch schnellere Dynamiken im Nanometerbereich
beobachten zu können, wurde außerdem STED
Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (STED FCS) in
Zusammenhang mit den beschriebenen Färbemethoden
eingesetzt. Damit konnten nanoskopische Details der
Dynamik von membrangeankerten Proteinen aufgelöst
werden, die mit herkömmlichen, beugungsbegrenzten
FCS-Experimenten nicht zugänglich sind. Mit den in
dieser Arbeit erzielten Resultaten können viele
fluoreszenzmikroskopische Studien in lebenden Zellen,
für die bisher ein herkömmliches, auflösungsbegrenztes
Konfokalmikroskop genutzt wurde, mit dem stark erhöhten
Auflösungsvermögen der STED Mikroskopie durchgeführt
werden. Dadurch ist der Weg für weitere und
detailliertere Einsichten in den belebten Nanokosmos
bereitet.
Schlagwörter: STED; GFP; Fluoreszenz; Lebendzell-Mikroskopie