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dc.contributor.advisor Hell, Stefan Prof. Dr. de
dc.contributor.author Hein, Birka de
dc.date.accessioned 2009-08-05T12:10:48Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T10:39:08Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:24Z de
dc.date.issued 2009-08-05 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B674-0 de
dc.description.abstract Die Fernfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist ein Untersuchungsverfahren von herausragender Bedeutung in den modernen Biowissenschaften. Als nichtinvasive, berührungsfreie Methode wird sie besonders zur Untersuchung lebender Proben eingesetzt. Heutzutage ist auch der größte Nachteil der Lichtmikroskopie, nämlich ihr begrenztes Auflösungsvermögen, beseitigt, indem durch Licht zwischen verschiedenen Zuständen des Farbstoffes hin- und hergeschaltet wird. Die STimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie war die erste praktisch umgesetzte Fernfeld-Methode, die in Bildern mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze resultierte. Bisher war die STED-Mikroskopie allerdings allgemein auf die Untersuchung fixierter und somit toter Proben beschränkt, weil das benutzte Färbeverfähren, die Immunohistochemie, in den meisten Fällen Permeabilisierung und damit auch Fixierung der Probe voraussetzt. In dieser Arbeit wurde die STED Mikroskopie in lebenden Proben etabliert. Dazu wurden zwei verschiedene Färbeansätze genutzt: Mit Abkömmlingen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), welches vielfach in herkömmlicher Lebendzell-Mikroskopie Verwendung findet, wurde eine Auflösung von 50 nm in der lateralen und 150 nm in der axialen Richtung in lebenden Zellen erreicht. Außerdem wurden genetisch kodierte Markierungsproteine genutzt, die modifizierte organische Farbstoffe binden können. Auf diese Weise wurden Details von bis zu 40 nm in lebenden Zellen aufgelöst. Beide Methoden erlauben außerdem das Aufnehmen von nanoskopischen Videos, in denen strukturelle Veränderungen beobachtet werden, wie in dieser Arbeit anhand von mehreren Beispielen gezeigt wurde. Um noch schnellere Dynamiken im Nanometerbereich beobachten zu können, wurde außerdem STED Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (STED FCS) in Zusammenhang mit den beschriebenen Färbemethoden eingesetzt. Damit konnten nanoskopische Details der Dynamik von membrangeankerten Proteinen aufgelöst werden, die mit herkömmlichen, beugungsbegrenzten FCS-Experimenten nicht zugänglich sind. Mit den in dieser Arbeit erzielten Resultaten können viele fluoreszenzmikroskopische Studien in lebenden Zellen, für die bisher ein herkömmliches, auflösungsbegrenztes Konfokalmikroskop genutzt wurde, mit dem stark erhöhten Auflösungsvermögen der STED Mikroskopie durchgeführt werden. Dadurch ist der Weg für weitere und detailliertere Einsichten in den belebten Nanokosmos bereitet. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nd/2.0/de/ de
dc.title Live Cell STED Microscopy using Genetically Encoded Markers de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Lebendzell-STED-Mikroskopie mit genetisch kodierten Markierungen de
dc.contributor.referee Troe, Jürgen Prof. Dr. de
dc.date.examination 2009-07-02 de
dc.subject.dnb 500 Naturwissenschaften allgemein de
dc.description.abstracteng Far-field fluorescence microscopy is a tool of outstanding importance in the biological sciences, due to its non-invasiveness especially for the investigation of living cells, tissue and animals. Today also the major drawback in light microscopy, namely its limited resolution, has been overcome by utilizing photoswitching between different states of the fluorophore. STimulated Emission Depletion (STED) microscopy was the first farfield fluoresence nanoscopy approach to evolve, offering images with a resolution far beyond the diffraction barrier. However, until now STED microscopy was mostly confined to imaging fixed and therefore dead samples, because immunocytochemistry, the method of choice for fluorescence labeling for STED microscopy, requires in most cases the permeabilization and therefore fixation of the specimen. In this work, STED microscopy in living cells has been established. Two different labeling approaches have been applied: By using derivatives of green fluorescent protein (GFP), which is widely used in conventional live cell imaging, a resolution of 50 nm in the lateral and 150 nm in the axial direction within living cells is achieved. Alternatively, genetically encoded tagging proteins capable of binding modified organic dyes are employed. Structures as small as 40 nm can be discerned in living cells by this method. Both approaches also allow for watching structural changes on the nanoscale within the cell by taking time-lapse image series, as shown in various examples in this work. To monitor even faster processes on the nanoscale, STED fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is applied in conjunction with these labeling approaches, elucidating nanoscopic details of the dynamics of membraneanchored proteins not observable with conventional confocal FCS. By utilizing these results, many ongoing fluorescence microscopy studies in living cells, which are currently performed with a diffraction-limited confocal microscope, can be carried out with a substantially improved spatial resolution in all directions by means of STED microscopy. Altogether, this paves the way for new insights into a bustling nanocosmos. de
dc.contributor.coReferee Hell, Stefan Prof. Dr. de
dc.subject.topic Mathematics and Computer Science de
dc.subject.ger STED de
dc.subject.ger GFP de
dc.subject.ger Fluoreszenz de
dc.subject.ger Lebendzell-Mikroskopie de
dc.subject.eng STED de
dc.subject.eng GFP de
dc.subject.eng Fluorescence de
dc.subject.eng Live Cell Microscopy de
dc.subject.bk 35.10 Physikalische Chemie: Allgemeines de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-2185-2 de
dc.identifier.purl webdoc-2185 de
dc.affiliation.institute Fakultät für Chemie de
dc.identifier.ppn 610573284 de

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