Crystalline, membrane-embedded, and fibrillar proteins investigated by solid-state NMR spectroscopy
Untersuchung kristalliner, membranständiger und fibrillärer Proteine mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie
by Robert Schneider
Date of Examination:2009-01-30
Date of issue:2009-08-10
Advisor:Prof. Dr. Konrad Samwer
Referee:Prof. Dr. Christian Griesinger
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
This thesis describes research on atomic structure and molecular dynamics of biomolecules in the solid phase using solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. A method for detecting residue-specific mobility using double-quantum (13C,13C) spectroscopy was developed on a small model system and applied to the 76-residue protein ubiquitin. Together with a structure calculation employing an automated algorithm, results allowed to relate preparation-dependent chemical-shift changes in this protein to local differences in mobility or conformation. Work on the potassium channel KcsA-Kv1.3 in lipid bilayers led to resonance assignments for 59% of its residues. Secondary structure of its pore domain was found to closely resemble that of the parent KcsA channel, but differences became apparent with respect to KcsA preparations in micelles, highlighting the influence of the membrane environment. In close reference to functional experiments, activation and inactivation gating in KcsA-Kv1.3 and their dependence on pH and potassium concentration were investigated. At acidic pH, KcsA-Kv1.3 was found to reside in an open-inactivated conformation. It is characterized by bent inner transmembrane helices, corresponding to an opened activation gate, and by a nonconductive selectivity filter conformation, i.e. a closed inactivation gate. The open-inactivated state of KcsA-Kv1.3 was demonstrated to be correlated with protonation of specific glutamate residues. It is also strongly influenced by the potassium concentration. Potassium affects the conformation of both activation and inactivation gates via binding to the selectivity filter, providing a mechanism for gate coupling and coordinated gating transitions. Finally, fibrillar aggregates formed by disease-relevant polyglutamine peptides were investigated structurally. Experimental data argue against water-filled beta-helical models and are best explained by an antiparallel, superpleated cross-beta structure with a polar zipper arrangement of tightly interdigitated, hydrogen-bonded sidechains.
Keywords: NMR; solid state; MAS; protein structure; membrane protein; protein aggregates; KcsA; polyglutamine
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Die vorliegende Arbeit beschreibt Untersuchungen von
atomarer Struktur und molekularer Dynamik von
Biomolekülen in fester Phase mittels kernmagnetischer
Resonanzspektroskopie. An einem kleinen Modellsystem
wurde eine Methode zur Messung lokaler molekularer
Mobilität entwickelt, die auf
(13C,13C)-Doppelquantenspektroskopie basiert. Diese
Methode wurde auf das 76-Reste-Protein Ubiquitin
angewendet. Mit den Ergebnissen dieser Messungen sowie
einer automatisierten Strukturrechnung konnte gezeigt
werden, dass präparationsabhängige Änderungen in den
chemischen Verschiebungen dieses Proteins vorwiegend in
Regionen auftreten, in denen sich Konformation oder
Dynamik zwischen den Probenpräparationen unterscheiden.
Weiterhin wurde der Kalium-Ionenkanal KcsA-Kv1.3 in
einer Lipidmembranumgebung spektroskopisch untersucht.
Für 59% der Aminosäurereste dieses Proteins konnten
Resonanzen zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass die
Sekundärstruktur im Transmembranbereich dieses Kanals
derjenigen des nahe verwandten Proteins KcsA sehr
ähnlich ist. Im Vergleich zu KcsA-Präparationen in
Micellen wurden jedoch Unterschiede gefunden, was den
Einfluss der Membranumgebung auf das Protein
verdeutlicht. Die Vorgänge der Aktivierung und
Inaktivierung dieses Ionenkanals sowie ihre
Abhängigkeit von pH-Wert und Kaliumkonzentration wurden
untersucht, wobei auf elektrophysiologische Experimente
zur Funktion des Kanals Bezug genommen wurde. Bei
saurem pH zeigten die spektroskopischen Daten eine
offen-inaktivierte Konformation von KcsA-Kv1.3. In
diesem Zustand liegen die inneren Transmembran-Helices
gekrümmt vor, wodurch das Aktivierungs-Gate geöffnet
wird, und der Selektivitätsfilter nimmt eine
nichtleitende Konformation ein, was einem geschlossenen
Inaktivierungs-Gate entspricht. Es wurde gezeigt, dass
der offen-inaktivierte Zustand von KcsA-Kv1.3 mit der
Protonierung bestimmter Glutamat-Reste korreliert ist
und außerdem stark von der Kaliumkonzentration abhängt.
Kalium beeinflusst die Konformation sowohl des
Aktivierungs- als auch des Inaktivierungs-Gate über
seine Bindung an den Selektivitätsfilter. Dieser
Mechanismus koppelt die beiden Proteinbereiche und
ermöglicht koordinierte Konformationsänderungen zum
Öffnen und Schließen des Kanals. Schließlich wurden
krankheitsrelevante fibrilläre Aggregate aus
Polyglutamin-Peptiden strukturell untersucht. Die
experimentellen Daten sprechen gegen eine
wassergefüllte, beta-helikale Struktur und lassen sich
durch antiparallele, übereinander angeordnete
Beta-Faltblätter mit eng verzahnten, durch
Wasserstoffbrücken verbundenen Seitenketten
erklären.
Schlagwörter: NMR; Festkörper; MAS; Proteinstruktur; Membranprotein; Proteinaggregate; KcsA; Polyglutamin