Crystalline, membrane-embedded, and fibrillar proteins investigated by solid-state NMR spectroscopy

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt Untersuchungen von atomarer Struktur und molekularer Dynamik von Biomolekülen in fester Phase mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie. An einem kleinen Modellsystem wurde eine Methode zur Messung lokaler molekularer Mobilität entwickelt, die auf (13C,13C)-Doppelquantenspektroskopie basiert. Diese Methode wurde auf das 76-Reste-Protein Ubiquitin angewendet. Mit den Ergebnissen dieser Messungen sowie einer automatisierten Strukturrechnung konnte gezeigt werden, dass präparationsabhängige Änderungen in den chemischen Verschiebungen dieses Proteins vorwiegend in Regionen auftreten, in denen sich Konformation oder Dynamik zwischen den Probenpräparationen unterscheiden. Weiterhin wurde der Kalium-Ionenkanal KcsA-Kv1.3 in einer Lipidmembranumgebung spektroskopisch untersucht. Für 59% der Aminosäurereste dieses Proteins konnten Resonanzen zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass die Sekundärstruktur im Transmembranbereich dieses Kanals derjenigen des nahe verwandten Proteins KcsA sehr ähnlich ist. Im Vergleich zu KcsA-Präparationen in Micellen wurden jedoch Unterschiede gefunden, was den Einfluss der Membranumgebung auf das Protein verdeutlicht. Die Vorgänge der Aktivierung und Inaktivierung dieses Ionenkanals sowie ihre Abhängigkeit von pH-Wert und Kaliumkonzentration wurden untersucht, wobei auf elektrophysiologische Experimente zur Funktion des Kanals Bezug genommen wurde. Bei saurem pH zeigten die spektroskopischen Daten eine offen-inaktivierte Konformation von KcsA-Kv1.3. In diesem Zustand liegen die inneren Transmembran-Helices gekrümmt vor, wodurch das Aktivierungs-Gate geöffnet wird, und der Selektivitätsfilter nimmt eine nichtleitende Konformation ein, was einem geschlossenen Inaktivierungs-Gate entspricht. Es wurde gezeigt, dass der offen-inaktivierte Zustand von KcsA-Kv1.3 mit der Protonierung bestimmter Glutamat-Reste korreliert ist und außerdem stark von der Kaliumkonzentration abhängt. Kalium beeinflusst die Konformation sowohl des Aktivierungs- als auch des Inaktivierungs-Gate über seine Bindung an den Selektivitätsfilter. Dieser Mechanismus koppelt die beiden Proteinbereiche und ermöglicht koordinierte Konformationsänderungen zum Öffnen und Schließen des Kanals. Schließlich wurden krankheitsrelevante fibrilläre Aggregate aus Polyglutamin-Peptiden strukturell untersucht. Die experimentellen Daten sprechen gegen eine wassergefüllte, beta-helikale Struktur und lassen sich durch antiparallele, übereinander angeordnete Beta-Faltblätter mit eng verzahnten, durch Wasserstoffbrücken verbundenen Seitenketten erklären.