Induktion und Spezifikation serotonerger Neurone des ventralen Rhombencephalon der Maus
Induction and specification of serotonergic neurons from mouse ventral rostral hindbrain
von Nadja Osterberg
Datum der mündl. Prüfung:2009-01-12
Erschienen:2009-10-26
Betreuer:Prof. Dr. Eleni Roussa
Gutachter:Prof. Dr. Gregor Bucher
Gutachter:Prof. Dr. Ralf Heinrich
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The serotonergic (5-HT) system is involved in the modulation of mood and behaviour. Extrinsic factors, such as fibroblast growth factor 4 (Fgf4), Fgf8, and sonic hedghog (Shh), dictate the development of hindbrain 5-HT neurons. In addition, the developmental network is regulated by transcription factors, such as Nkx2.2, Lmx1b, Gata2, and Pet1. However, the regulatory network of extrinsic and intrinsic factors directing the development of 5-HT neurons is not fully elucidated. In order to complete the network, a primary neurospheres culture system from mouse ventral rostral hindbrain embryonic day (E) 12 has been established. This model system exhibits the main characteristics of progenitor cells: a) the ability to proliferate and b) the capacity of multilineage differentiation. Hereby it allows the enrichment of progenitor cells, and also triggers these cells towards a specific cell fate. Tgf-b treatment of primary neurospheres from mouse ventral rostral hindbrain (E12) does not influence the expression of Gata2. However, the functional blocking of Tgf-b signalling results in a significant down regulation of Gata2, indicating that the maintenance of Gata2 expression is Tgf-b dependent. Treatment of primary neurospheres with Tgf-b has no effect on Pet1 expression, whereas the inhibition of Tgf-b signaling led to a significant down regulation of Pet1 expression. These results suggest a role of Tgf-b in regulating the differentiation of progenitors towards the terminal 5-HT phenotyp via the maintenance of Gata2 and Pet1 expression. Additionally, the function of the transcription factor Sim1 (Single-minded homolog 1), the murine homologue of sim, a master regulator of CNS midline formation in D. melanogaster, in the development of 5-HT neurons has been analysed. Immunohistological analysis of newborn Sim1 −/− mice compared with wt littermates revealed a significantly reduced number of 5-HT neurons within a 5-HT neuron subpopulation, the dorsal raphe nucleus, at about 30%. The underlying molecular mechanisms were investigated by gain- and loss-offunction experiments using the MN9D cell line. Gene expression changes were analysed after Sim1 overexpression by quantitative Real-Time-PCR. Sim1 overexpression did not result in an upregulation of Gata2. In contrast, a significant upregulation of the expression of Pet1 after Sim1 overexpression has been observed and confirmed after down-regulating Sim1 by transfection using Sim1 specific siRNA. Moreover, an upregulation of Tph2 expression was observed after Sim1 overexpresion. These data suggest a relevance of Sim1 for the differentiation of 5-HT neurons, and allow to position Sim1 upstream Pet1 and Tph2 within the regulatory network directing the formation of 5-HT neurons. In order to identify new members of the regulatory network directing the development of 5-HT neurons, a cDNA microarray has been performed, comparing the gene expression pattern of mouse ventral midbrain with that of ventral rostral hindbrain, E11. Three genes highly upregulated in ventral hindbrain, were further investigated by Sim1 overexpression in MN9D cells: Rgs4, a regulator of G-protein coupled receptors, such as 5-HT receptors, and the transcription factors Brn3.2 and Lhx8. Sim1 overepression led to a significant upregulation of Rgs4 and Brn3.2. In summary, the results indicate a role of Sim1 during the late development of 5-HT neurons, at least in a subpopulation of 5-HT neurons, either directly, on Tph2 and Pet1 by regulating their expression, or indirectly via induction of Brn3.2. Furthermore the results suggest an indirect regulation of serotonin release by Sim1 via Rgs4, and thereby directing the development of 5-HT neurons themself and their target areas.
Keywords: primary neurospheres; raphe; rhombencephalon; serotonergic neurons
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Das serotonerge (5-HT) System ist maßgeblich an der
Modulation des Verhaltens und der Gemütslage beteiligt.
In ihrer Entwicklung sind 5-HT-Neurone des
Rhombencephalon von extrinsischen Faktoren wie Fgf4
( Fibroblast growth factor 4 ), Fgf8 und Shh ( Sonic
hedghog ) sowie u. a. von den Transkriptionsfaktoren
Nkx2.2, Lmx1b, Gata2 und Pet1abhängig. Bis heute ist,
über die genannten extrinsischen und intrinsischen
Faktoren hinausgehend, die Steuerung der Entwicklung
von 5-HT-Vorläuferzellen hin zum terminalen
5-HT-Phänotyp nicht vollständig aufgeklärt. Ziel der
vorliegenden Arbeit war es daher, das regulatorische
Netzwerk der 5-HT-Neuronenentwicklung zu ergänzen.
Hierzu wurde zunächst das Kultursystem primärer
Neurospheres des ventralen rostralen Rhombencephalon
der Maus des Embryonaltages (E) 12 etabliert und
charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass diese
primären Neurospheres grundlegende Eigenschaften von
Vorläuferzellen aufweisen: a) die Fähigkeit zur
Proliferation und b) die Möglichkeit, sich in
unterschiedliche neurale Zelltypen zu differenzieren.
Somit ermöglicht dieses Modellsystem die Anzahl von
Vorläuferzellen zu erhöhen und die Zellen in Richtung
eines bestimmten zellulären Schicksals zu steuern.
Dieses Kulursystem wurde verwendet, um zunächst den
Einfluss des extrinsichen Signalmolekül Tgf-b
( Transforming growth factor-b ) auf die Entwicklung
von 5-HT-Neuronen untersucht. Behandlung primärer
Neurospheres mit Tgf-b führte zu keiner Steigerung der
Gata2-Expression. Neutralisation endogen
synthetisierten Tgf-b resultierte hingegen in einer
signifikanten Herabregulation von Gata2.
Tgf-b-Behandlung primären Neurospheres des ventralen
rostralen Rhombencephalon der Maus (E12) bedingte keine
Erhöhung der Pet1-Expression. Eine funktionelle
Blockierung der Tgf-b-abhängigen
Signaltransduktionskaskade führte jedoch zu einer
signfikanten Reduktion der Pet1-Transkription. Hieraus
kann gefolgert werden, dass Tgf-b auf die
Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu
5-HT-Neuronen über die Aufrechterhaltung der Gata2- und
Pet1-Expression Einfluss nimmt.
Neben Tgf-b wurde die Bedeutung des
Transkriptionsfaktors Sim1 ( Single-minded homolog 1 )
für die Entwicklung von 5-HT-Neuronen analysiert. Die
Deletion des Sim1-Gens äußert sich in neugeborenen
Sim1-defizienten Mäusen in einer Reduktion der Anzahl
5-HT-Neuronen einer Subpopulation, dem Nucleus dorsalis
raphe, um 30%. Die diesem Befund zugrunde liegenden
molekularen Regulationsmechanismen wurden durch
Sim1-Überexpressions- und Sim1-spezifische
siRNA-Experimente in MN9D-Zellen untersucht. Durch
Analyse der Änderungen des Genexpressionmusters nach
Sim1-Überexpression konnte gezeigt werden, dass Sim1
die Expression von Gata2 nicht induziert. Die
Expression der Gene Pet1 und Tph2 wurde im Gegensatz
hierzu durch eine Sim1-Überexpression in MN9D-Zellen
signifikant gesteigert. Dies zeigt, dass Sim1 zwar
keine Bedeutung für die Induktion wohl aber für die
Differenzierung von 5-HT-Neuronen über eine Regulation
von Pet1 sowie Tph2 besitzt. Somit konnte Sim1 eine
bisher unbekannte Funktion innerhalb des
transkriptionellen Netzwerkes der
5-HT-Neuronenentwicklung zugewiesen werden. Um bisher
unbekannte Elemente des regulatorischen Netzwerkes der
Entwicklung 5-HTNeuronen zu identifizieren, wurde ein
cDNA-Mikroarray durchgeführt und das
Genexpressionsmuster des ventralen rostralen
Rhombencephalon mit dem des ventralen Mesencephalon
(E11) der Maus verglichen. Drei der im ventralen
Rhombencephalon im Vergleich zum ventralen
Mesencephalon am stärker exprimierten Gene wurden durch
Sim1- Überexpessionsversuche auf eine denkbare
Sim1-abhängige Expressionsregulation in MN9D-Zellen
untersucht: Rgs4, ein Regulator G-Protein-gekoppelter
Rezeptoren, wie 5-HT-Rezeptoren, sowie die
Transkriptionsfaktoren Brn3.2 und Lhx8. Eine
Überexpression von Sim1 führte zu einer signifikanten
Steigerung der Expression von Rgs4 und Brn3.2.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse daraufhin, dass
Sim1 die späte Entwicklungsphase von 5-HT-Neuronen
durch Regulation der Expression von Pet1 und Tph2
zumindest in einer Subpopulation steuert. Es ist
denkbar, dass dies indirekt über eine Sim1-abhängige
Regulation der Expression von Brn2.3 erfolgt. Des
Weiteren ist eine funktionelle Regulation der
Serotonin-Freisetzung durch Sim1, vermittelt über Rgs4,
denkbar, wodurch die Entwicklung von 5-HT-Neuronen
selbst und von ihnen innervierten Gehirnregionen
beeinflusst wird.
Schlagwörter: primäre Neurospheres; Raphe; Rhombencephalon; serotonerge Neurone