Resistenzentwicklung des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 gegen Azidothymidin in Zellkultur

Abstract

Eine Resistenz gegen AZT kann sich sowohl auf viraler als auch auf zellulärer Ebene entwickeln. Wir wiesen AZT-resistente HIV-1 Varianten nach Passagen des HIV-1 in humanen T-Zelllinien in der Gegenwart von AZT nach. Während 18 Monaten war die genetische Variabilität von HIV in persistent infizierten Jurkat-Zellen und in Synzytien-bildenden Molt-4 und Molt-4 Klon-8 Zellen nicht ausreichend, um mit dem molekularen Klon pNL43 resistente Viren herzustellen. Aus dem klinischen Isolat HIV-1IIIB selektierten wir hingegen innerhalb von 5 Wochen resistente Varianten. Die resistenten Viren wurden mit PCR, Antigen-ELISA, Aktivitätstest der Reversen Transkriptase, Synzytientest und Immunfluoreszenztest nachgewiesen. Konzentrationen von bis zu 3000 µM AZT konnten die Virusproduktion nicht verringern. Diese Konzentration ist 200.000-fach höher als die Inhibitionsdosis für HIV-1IIIB und sie ist für humane T-Zelllinien toxisch. Diese resistenten Viren konnten alle untersuchten Zelltypen einschließlich humaner peripherer Blutlymphozyten infizieren.Da sich die Sensitivität der Reversen Transkriptase gegenüber AZT-TP im Laufe der Viruspassagen nicht veränderte und die Mutationen im Pol-Gen sich von den bis dahin bekannten Mutationen für eine AZT-Resistenz unterschieden, wurde ein zellulärer Resistenzmechanismus angenommen und untersucht.Die Konzentration des Multidrug-Resistenzproteins (mdr P170) wurde mittels Durchflusszytometrie in uninfizierten und HIV-1 infizierten T-Zelllinien und in humanen Lymphozyten gemessen. Das Mdr P170 wird in HIV-1 infizierten Zellen stärker exprimiert als in uninfizierten Zellen. Die zelluläre AZT-Aufnahme und Abgabe wurde mit 3H-AZT und AZT in Gegenwart der Inhibitoren Verapamil und Forskolin untersucht. Die intrazelluläre AZT-Konzentration aller untersuchten Zellen stieg während der ersten 60 Minuten Inkubationszeit in AZT-Medium an und sank danach bis zum Ende der Inkubationszeit signifikant ab. Verapamil konnte den AZT-Ausstrom in den untersuchten Zellen nicht verhindern und verringerte die AZT-Aufnahme in Lymphozyten, aber nicht in uninfizierten und in HIV-1 infizierten Jurkat-Zellen. Forskolin verzögert die Aufnahme von AZT in allen untersuchten Zelllinien und führt zu einem Steady State der intrazellulären AZT-Konzentration. Daher nehmen wir an, dass der AZT-Transport neben passiver Diffusion von einem aktiven Transportsystem vermittelt wird und dass AZT durch ein zelluläres Resistenzsystem ausgeschleust wird. Der Mdr P170 Resistenzmechanismus könnte ein wichtiger limitierender Faktor für die Wirksamkeit verschiedener chemotherapeutischer Agenzien sein, die in der Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden.