BACE1 dependent function of Neuregulin1 in peripheral nervous system myelination

BACE1 dependent function of Neuregulin1 in peripheral nervous system myelination

BACE1-vermittelte Funktion von NRG1 in der Myelinisierung des peripheren Nervensystems

Viktorija Velanac

Doctoral thesis

Date of Examination: 2010-01-15

Date of issue: 2010-05-26

Advisor: Nave, Klaus-Armin Prof. Dr.

Referee: Nave, Klaus-Armin Prof. Dr.

Referee: Brück, Wolfgang Prof. Dr.

Referee: Ehrenreich, Hannelore Prof. Dr. Dr.

Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B689-2

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Description: Dissertation

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Abstract

English

The neuronal epidermal growth factor (EGF)-like growth factor NRG1 type III serves as a master regulator of myelination in the peripheral nervous system (PNS). It has been proposed that NRG1 type III is proteolytically cleaved to become fully active, but the identity of the protease(s) as well as the number and order of cleavage events have been elusive. Peripheral myelination is strongly impaired in BACE1 (-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1) null mutants, very similar to NRG1 type III heterozygous mouse mutants, suggesting that BACE1-processing is required for the myelinating activity of NRG1 type III. However, a functional interaction between NRG1 type III and BACE1 in vivo has not been demonstrated. In this study, we have used transgenic mouse lines that neuronally overexpress N-terminally epitope-tagged full length NRG1 type III and a C-terminally shortened NRG1 type III-variant that mimics BACE1 processing in the stalk region ( GIEF ) to further explore NRG1 processing and a functional interaction between BACE1 and NRG1 type III in myelination in vivo. Neuronal overexpression of the GIEF -variant induces sciatic nerve hypermyelination, very similar to full length NRG1 type III. This demonstrates that the product of BACE1-mediated cleavage in the stalk region is myelination competent, whereas back signalling by the cytoplasmic tail of NRG1 type III is dispensable for myelination. Unexpectedly, overexpression of NRG1 type III retains the potential to promote myelination in BACE1 null mutants, albeit at reduced capacity. These findings identify a functional interaction of BACE1 and NRG1 in peripheral myelination in vivo, but also point to more complex processing mechanisms involving other proteases. We also took advantage of the in vivo-expression of epitope-tagged NRG1-variants to study the subcellular localization and transport of NRG1-variants in spinal cord motor neurons. Histological and biochemical analysis strongly suggest that subsequently to cleavage in the stalk region, N- and C-terminal NRG1 type III-fragments are sorted to distinct membrane domains and that vesicular transport of the N-terminal fragment (harboring the EGF-like domain) into the axonal compartment is rate-limiting. Finally, we observed an additional smaller-sized N-terminal product in sciatic nerve, compatible with EGF-like domain shedding from the axonal surface. Thus, our data strongly suggest an orderly array of proteolytic processing as a critical component of NRG1 type III-mediated peripheral myelination.

Keywords: Neuregulin1; myelination; BACE1

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Der neuronale Wachstumsfaktor Neuregulin (NRG) 1 Typ III ist der maßgebliche Regulator der Myelinisierung im peripheren Nervensystem (PNS). Zur Aktivierung von NRG1 Typ III ist vermutlich eine proteolytische Spaltung notwendig, aber die Identität der Protease(n) sowie die Anzahl und Reihenfolge der einzelnen Prozessierungsschritte sind bisher ungeklärt. Ähnlich wie in heterozygoten NRG1 Typ III-Mutanten ist die periphere Myelinisierung in BACE1 (β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1)-Nullmutanten stark beeinträchtigt. Dies deutet daraufhin, dass eine Prozessierung durch BACE1 für die Myelinisierungsfunktion von NRG1 Typ III notwendig ist. Allerdings konnte bislang keine funktionelle Interaktion von NRG1 Typ III und BACE1 in vivo gezeigt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Interaktion zwischen BACE1 und NRG1 Typ III bei der Myelinisierung wurden in dieser Studie zwei transgene Mauslinien verwendet, die eine Volllängevariante bzw. eine am C-terminus verkürzte NRG1 Typ III-Variante neuronal überexprimieren. Die verkürzte Variante entspricht dabei dem Produkt der BACE1-Prozessierung in der Juxtamembranregion ( GIEF ). Beide Varianten wurden am N-terminus mit einem Peptidepitop markiert, um auch die Prozessierung und subzelluläre Lokalisation der NRG1-Varianten in vivo genauer zu untersuchen. Die neuronale Überexpression der GIEF -Variante verursacht eine Hypermyelinisierung des Ischiasnervens, vergleichbar mit der Volllängeform von NRG1 Typ III. Diese Beobachtung zeigt, dass die GIEF -Variante ein myelinisierungskompetentes Produkt der BACE1-vermittelten Prozessierung von NRG1 Typ III darstellt, während die zytoplasmatische Domäne von NRG1 Typ III für die Myelinisierung entbehrlich ist. Überraschenderweise bewahrt die Überexpression von NRG1 Typ III ihr myelinisierungsförderndes Potenzial selbst in BACE1 Nullmutanten, wenn auch in verringertem Ausmaß. Diese Befunde identifizieren eine funktionale Interaktion von BACE1 und NRG1 bei der peripheren Myelinisierung in vivo, deuten aber auf einen komplexeren Prozessierungsmechanismus hin, an dem weitere Proteasen beteiligt sind. Die Verwendung von Epitop-markierten NRG1-Varianten wurde auch dazu genutzt, die subzelluläre Lokalisation und den Transport von NRG1-Varianten in Motorneuronen des Rückenmarks näher zu untersuchen. Histologische und biochemische Analysen deuten daraufhin, dass N- und C-terminale Prozessierungsprodukte nach der Spaltung in der Juxtamembranregion in unterschiedliche Membrandomänen sortiert werden und der vesikuläre Transport N-terminaler Prozessierungsprodukte (einschließlich der EGF-ähnlichen Domäne) in das axonale Kompartiment limitiert ist. Außerdem wurde ein weiteres kleineres N-terminales Produkt in Proteinextrakten aus Ischiasnerven beobachtet, das auf eine Abspaltung der EGF-ähnlichen Domäne von der Axonoberfläche hinweist. Diese Beobachtungen deuten auf eine geregelte Abfolge proteolytischer Prozessierungsschritte hin, die eine wichtige Rolle bei der NRG1 Typ III-vermittelten Myelinisierung des peripheren Nervensystems spielen.

Schlagwörter: Neuregulin1; Myelinisierung; BACE1