UPSTREAM PATHWAYS REGULATING ERYTHROPOIETIN GENE EXPRESSION IN THE LIVER DURING ACUTE PHASE RESPONSE: A CENTRAL ROLE FOR IL-6.
ERYTHROPOIETIN GENE EXPRESSION IN TWO MURINE MODELS OF APR.
Vorgeschaltete Stoffwechselwege regulieren die Erythropoietin-Genexpression in der Leber während der Akute-Phase-Antwort: Eine zentrale Rolle für IL-6
Erythropoietin-Genexpression in zwei modellen der Akute-Phase Reaktion
von Pierluigi Ramadori
Datum der mündl. Prüfung:2010-04-22
Erschienen:2010-08-18
Betreuer:Prof. Dr. Dr. h.c. Giuliano Ramadori
Gutachter:Prof. Dr. Jürgen Wienands
Gutachter:Prof. Dr. Michael Kessel
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The acute phase response is the systemic reaction of an organism to insults like infection, trauma, or burning and it represents the first line of defense of the body to tissue-damaging attacks.The source of circulating erythropoietin (EPO), the mediators and the mechanisms involved in the up-regulation of EPO-gene-expression during acute-phase reaction are still poorly understood. Acute phase reaction was induced either by intramuscular turpentine oil (TO) or intraperitoneal LPS injection into wild type and IL-6 knockout (KO) mice. Animals were sacrificed at different time points and blood, liver and muscle tissue were collected. Serum levels of erythropoietin were measured by ELISA; liver and injured muscle samples were processed for RNA isolation and for protein analysis. EPO, HIF-1alpha and HIF-2alpha-mRNA was analysed by RT-PCR and the protein levels by western blot and EMSA. HIF-1alpha and HIF-2alpha localization was performed through immunofluorecence staining. EPO, HIF-1 and HIF-2 gene and protein expression were also analyzed in isolated mouse hepatocytes following stimulation with IL-6. In the wild type animals erythropoietin serum levels increased dramatically at 12h after the insults together with the hepatic gene expression. In TO-treated animals the EPO-gene expression reached a peak of 8.2-fold increase at 12h and in LPS treated mice a similar induction was recorded at 6 hours (about 4.5-fold increase). In the IL6KO strain, the up-regulation after the inflammatory stimuli was much lower (only 2.0-fold increase). A progressive up-regulation of HIF-1alpha and HIF-2alpha was detectable until 6 hours after the insults, but only HIF-1alpha up-regulation was reduced in IL-6KO mice. In isolated hepatocytes, stimulation with a single dose of IL-6 induced a nuclear accumulation of HIF-1alpha, in parallel with an increase of EPO mRNA. No effect on HIF-2alpha expression was reported. These results suggest that EPO may be added to the increasing group of positive acute phase-proteins and it might represent the major source of the hormone under these conditions in murine liver. Interleukin-6 appears to be the main regulator of EPO-gene-expression and a major contributor for HIF-1alpha induction in hepatocytes and Kupffer cells during acute-phase-response. The increase of HIF-2alpha, predominantly expressed in endothelial cells and fibroblast-like cells, seems not to be affected by the lack of IL-6.
Keywords: erythropoietin; liver; acute-phase reaction; hepatocytes; HIF
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Die Herkunft des zirkulierenden Erythropoietins
(EPO), der beteiligten Mediatoren, sowie die Vorgänge,
die zu einer Hochregulierung der EPO-Gen-Expression
während einer Akute-Phase-Reaktion führen, sind noch
nicht abschließend verstanden. Durch die intramuskuläre
Injektion von Terpentinöl (TO) bzw. durch die
intraperitoneale Injektion von LPS in Wildtyp- und in
IL-6 Knockout-Mäuse, wurde eine Akute-Phase-Reaktion
induziert. Die Tiere wurden jeweils zu festgelegten
Zeitpunkten getötet und deren Blut, Leberzellen, sowie
Muskelgewebe entnommen. Mittels ELISA wurden die
Serumlevel des Erythropoietins gemessen; Gewebeproben
aus der Leber sowie dem Muskelgewebe wurden zur
RNA-Isolierung und zur Proteinanalyse aufgearbeitet.
EPO, HIF-1alpha- und HIF-2alpha-mRNA wurden mithilfe
RT-PCR analysiert, deren Proteinlevel mithilfe Western
Blot und EMSA. Durch Immunfluoreszenzfärbung konnte
eine Lokalisation von HIF-1alpha und HIF-2alpha
erfolgen. Nachdem die Hepatozyten der Mäuse isoliert
und mit IL-6 stimuliert wurden, konnten HIF-1- und
HIF-2-Gene, sowie deren Proteinexpression quantitativ
analysiert werden. In der Wildtyp-Population konnte 12
Stunden nach der Injektion ein dramatischer Anstieg der
Serumlevel sowie der hepatischen Genexpression des
Erythropoietins beobachtet werden. Die Tiere, die mit
TO behandelt wurden, erreichten einen 8.2-fach höheren
Anstieg der EPO-Genexpression nach 12 Stunden, Mäuse,
die mit LPS behandelt wurden, zeigten eine
vergleichbare Induktion der EPO-Genexpression bereits
nach 6 Stunden (mit einem 4.5-fach höheren Anstieg). In
der IL6KO- Züchtung fiel nach dem entzündlichen
Stimulus diese Erhöhung insgesamt viel niedriger aus
(nur 2.0-facher Anstieg). Ein zunehmender Anstieg von
HIF-1alpha und HIF-2alpha konnte bis 6 Stunden nach der
Verletzung beobachtet werden, in den IL-6KO-Mäusen kam
es lediglich zu einer leichten Erhöhung von HIF-1alpha.
Isolierte Hepatozyten, die durch die einmalige
Applikation von IL-6 stimuliert wurden, zeigten eine
Akkumulation von HIF-1alpha in den Zellkernen, parallel
zu einem Anstieg von EPO mRNA. Effekte auf die
Expression von HIF-2alpha blieben aus. Interleukin-6
scheint im Rahmen der Regulation der EPO-Gen-Expression
die entscheidende Rolle zu spielen, ebenso nimmt es
Einfluss auf die Expression von HIF-1alpha, das während
der Akute-Phase-Reaktion in Hepatozyten und
Kupfferzellen exprimiert wird. Der Anstieg von
HIF-2alpha, das vorwiegend in Endothelzellen und
Fibroblast-ähnlichen Zellen vorkommt, scheint durch das
Fehlen von IL-6 nicht beeinträchtigt.
Schlagwörter: erythropoietin; leber; Akute-Phase Reaktion; hepatocyten; HIF