Integration von Connexonen in Lipidmembranen auf porösen Oberflächen

Abstract

Das Connexin26 (Cx26) gehört zur Familie der Connexine. Bestehend aus 12 Connexin-Untereinheiten ermöglichen Gap Junction Kanäle die Kommunikation zwischen benachbarten Zellen durch eine passive Diffusion kleinerer Moleküle und Ionen. Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Alzheimer, Parkinson oder Depressionen gehören heutzutage zu den medizinisch und volkswirtschaftlich wichtigsten Herausforderungen. Auf Basis der Gap Junction vermittelten interzellulären Kommunikation soll in einem Verbundprojekt ein Biochip entwickelt werden, welcher es ermöglicht, Target Rezeptoren oder Ionenkanäle von Neuronen, exprimiert in einem zellulären System, zu untersuchen. Diese Zellen sollen ohne die Notwendigkeit der technisch sehr aufwendigen elektrischen Kontaktierung mittels Patch Clamp Elektroden untersucht werden. Die Kontaktierung soll mit einer elektrischen Kopplung der Zellen an eine Connexon-dotierte porenüberspannende Membran durch die Ausbildung von Gap Junctions zwischen den Zellen und dem artifiziellen Membransystem erzielt werden. Ein solches System würde ein Verfahren ermöglichen, welches essentiell für die Suche nach pharmakologisch aktiven Substanzen im Hochdurchsatz ist. Hinsichtlich dieser Anwendung ist die Integration von Connexonen in Lipidmembranen auf porösen Oberflächen ein wichtiger Meilenstein und daher Ziel dieser Doktorarbeit. Mit dem Cytochrom c basierten Vesikelassays kann zunächst nachgewiesen werden, dass der hexamere Connexon Halbkanal des Cx26 in einem einfachen artifiziellen Membransystem rekonstituiert und mittels Connexon spezifischer Blocker wie Carbenoxolon, Calciumionen und α-Cyclodextrin inhibiert werden kann. In einem nächsten Schritt werden zwei unterschiedliche Substrate und Rekonstitutionsmethoden genutzt, um die funktionelle Integration von Cx26 Connexonen in einer artifiziellen porenüberspannenden Membran nachzuweisen. Zum einen kann gezeigt werden, dass der Wildtyp des Cx26 aktive Halbkanäle ausbildet, wenn für die Rekonstitution in nano-BLMs eine detergenzbasierte Methode verwendet wird. Diese Technik konnte dafür genutzt werden, um neben dem Wildtyp des Cx26 die Mutanten M34A und V84L auf Einzelkanalniveau zu charakterisieren. Die elektrophysiologischen Charakteristika des M34A sind sehr ähnlich zu denen des Wildtyps, wohingegen die Mutante V84L ein deutlich verändertes Verhalten aufweist. Zum anderen wird Cx26 durch das Spreiten Connexon-dotierter riesiger unilamellarer Vesikel in mikro-BLMs auf einem mikroporösen Substrat rekonstituiert. Mittels eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers kann die Immobilität von Cx26 auf dem funktionalisierten Substrat nachgewiesen werden, wohingegen fluoreszenzmarkierte Lipide eine laterale Mobilität aufweisen. Mit einem Farbstofftransferassay auf Basis riesiger unilamellarer Vesikel kann abschließend ein erster Hinweis auf die Ausbildung funktioneller Cx26 Gap Junctions erlangt werden. In Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern des Verbundprojektes ist es daher in naher Zukunft möglich, das Ziel der Entwicklung einer Biochip-basierten Anwendung für die pharmakologische Wirkstoffsuche im Hochdurchsatzverfahren zu erreichen.