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Integration von Connexonen in Lipidmembranen auf porösen Oberflächen

Integration of connexons in lipid bilayers on porous substrates

von Helmut Albin Oliver Gaßmann
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2010-07-15
Erschienen:2010-08-18
Betreuer:Prof. Dr. Claudia Steinem
Gutachter:Prof. Dr. Christian Griesinger
crossref-logoZum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1983

 

 

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Name:gassmann.pdf
Size:8.25Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Zusammenfassung

Englisch

Connexin26 (Cx26) is a member of the connexin family, the building blocks for gap junction intercellular channels. These dodecameric assemblies are involved in gap junction-mediated cell-cell communication allowing the passage of ions and small molecules between two neighboring cells. As central nervous system diseases like Alzheimer, Parkinson or depressions are today one of the most important medical challenges and are accompanied by significant economical impact in our society we want to use this biological elementary communication pathway in a joint research project. The goal is to develop a biochip to assay target receptors or ion channels of neurons expressed in a cellular system. These cells are supposed to be investigated without the need to apply a technically elaborate electrical contact of the cellular interior via patch clamp electrodes. This cellular access shall be achieved via the electrical coupling of the cells on a connexon-doped pore suspending membrane and the formation of gap junctions between the cells and the artificial membrane system. This setup would lead to a high throughput detection system, which is essential in the quest to find new pharmacological active substances. Towards achieving this goal, the integration of connexons in lipid bilayers on porous substrates is a basic milestone to be achieved and therefor aim of this PhD thesis. Using a cytochrome c based vesicle assay we first prove, that the hexameric connexon hemichannels of Cx26 can be reconstituted in a simple artificial membrane system. We also demonstrate that its activity can be inhibited using Cx specific blockers like carbenoxolone, calcium ions and α-cyclodextrin. In a next step, two different substrates and reconstitution methods are used to prove the functional integration of Cx26 connexons in artificial pore suspending membranes. One the one hand, we are able to show that Cx26 wild-type forms active hemichannels when reconstituted with a detergent based method in nano-BLMs. Besides the wild-type, this technique was used to characterize the Cx26 mutants M34A and V84L on a single channel level, revealing a similar behavior of M34A and different properties of V84L compared to the wild-type. On the other hand, Cx26 is reconstituted in micro-BLMs via spreading of connexon-doped giant unilamellar vesicles on a microporous substrate. Using a fluorescently labeled antibody we provide evidence that Cx26 is immobile on the functionalized substrate, whereas fluorescently labeled lipids stay laterally mobile. With a giant unilamellar vesicle based dye transfer assay we finally succeed in obtaining the first evidence of a functional gap junction formation. Together with the work of our cooperation partners, the goal to provide a biochip based application for pharmacological high throughput screening will be within reach in the near future.
Keywords: Connexon; Gap Junction; Cx26; M34A; V84L; nano-BLM; micro-BLM; GUV; single channel recordings; CLSM; cytochrom ec

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Das Connexin26 (Cx26) gehört zur Familie der Connexine. Bestehend aus 12 Connexin-Untereinheiten ermöglichen Gap Junction Kanäle die Kommunikation zwischen benachbarten Zellen durch eine passive Diffusion kleinerer Moleküle und Ionen. Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Alzheimer, Parkinson oder Depressionen gehören heutzutage zu den medizinisch und volkswirtschaftlich wichtigsten Herausforderungen. Auf Basis der Gap Junction vermittelten interzellulären Kommunikation soll in einem Verbundprojekt ein Biochip entwickelt werden, welcher es ermöglicht, Target Rezeptoren oder Ionenkanäle von Neuronen, exprimiert in einem zellulären System, zu untersuchen. Diese Zellen sollen ohne die Notwendigkeit der technisch sehr aufwendigen elektrischen Kontaktierung mittels Patch Clamp Elektroden untersucht werden. Die Kontaktierung soll mit einer elektrischen Kopplung der Zellen an eine Connexon-dotierte porenüberspannende Membran durch die Ausbildung von Gap Junctions zwischen den Zellen und dem artifiziellen Membransystem erzielt werden. Ein solches System würde ein Verfahren ermöglichen, welches essentiell für die Suche nach pharmakologisch aktiven Substanzen im Hochdurchsatz ist. Hinsichtlich dieser Anwendung ist die Integration von Connexonen in Lipidmembranen auf porösen Oberflächen ein wichtiger Meilenstein und daher Ziel dieser Doktorarbeit. Mit dem Cytochrom c basierten Vesikelassays kann zunächst nachgewiesen werden, dass der hexamere Connexon Halbkanal des Cx26 in einem einfachen artifiziellen Membransystem rekonstituiert und mittels Connexon spezifischer Blocker wie Carbenoxolon, Calciumionen und α-Cyclodextrin inhibiert werden kann. In einem nächsten Schritt werden zwei unterschiedliche Substrate und Rekonstitutionsmethoden genutzt, um die funktionelle Integration von Cx26 Connexonen in einer artifiziellen porenüberspannenden Membran nachzuweisen. Zum einen kann gezeigt werden, dass der Wildtyp des Cx26 aktive Halbkanäle ausbildet, wenn für die Rekonstitution in nano-BLMs eine detergenzbasierte Methode verwendet wird. Diese Technik konnte dafür genutzt werden, um neben dem Wildtyp des Cx26 die Mutanten M34A und V84L auf Einzelkanalniveau zu charakterisieren. Die elektrophysiologischen Charakteristika des M34A sind sehr ähnlich zu denen des Wildtyps, wohingegen die Mutante V84L ein deutlich verändertes Verhalten aufweist. Zum anderen wird Cx26 durch das Spreiten Connexon-dotierter riesiger unilamellarer Vesikel in mikro-BLMs auf einem mikroporösen Substrat rekonstituiert. Mittels eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers kann die Immobilität von Cx26 auf dem funktionalisierten Substrat nachgewiesen werden, wohingegen fluoreszenzmarkierte Lipide eine laterale Mobilität aufweisen. Mit einem Farbstofftransferassay auf Basis riesiger unilamellarer Vesikel kann abschließend ein erster Hinweis auf die Ausbildung funktioneller Cx26 Gap Junctions erlangt werden. In Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern des Verbundprojektes ist es daher in naher Zukunft möglich, das Ziel der Entwicklung einer Biochip-basierten Anwendung für die pharmakologische Wirkstoffsuche im Hochdurchsatzverfahren zu erreichen.
Schlagwörter: Connexon; Gap Junction; Cx26; M34A; V84L; nano-BLM; mikro-BLM; GUV; Einzelkanalmessungen; CLSM; Cytochrom c
 

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