Absolute and relative quantification of proteins in large protein-RNA assemblies by mass spectrometry
Absolute und relative Quantifizierung von Proteinen in großen Protein-RNA-Komplexen mittels Massenspektrometrie
by Carla Schmidt
Date of Examination:2010-06-08
Date of issue:2010-09-07
Advisor:Dr. Henning Urlaub
Referee:Dr. Henning Urlaub
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The majority of cellular processes is driven by protein complexes. These emerge as multimeric protein assemblies or are complexed with ligands such as RNA or DNA. To understand the details of the cellular process, an analysis of the protein complexes is required. This involves the identification of the protein components, the determination of the protein stoichiometries, the relative quantification of different complex states, and the study of protein-protein or protein-ligand interactions. Several mass spectrometry-based techniques have been developed to tackle these problems and greatly facilitating the high throughput analysis of protein complexes. In this study, these methods have been applied to the spliceosome, which is a protein-RNA machinery that catalyzes the excision of introns and the ligation of exons during eukaryotic pre-mRNA splicing. We used absolute and relative quantification by mass spectrometry to characterize different spliceosomal complexes or subcomplexes, in terms of their protein composition and protein stoichiometry. One spliceosomal subcomplex, the hPrp19/CDC5L complex, consists of seven individual proteins (hPrp19, Hsp70, CTNNBL1, PRL1, CDC5L, AD-002, and SPF27) and plays a crucial role in the assembly of a catalytically active spliceosome. The exact protein stoichiometries within this particular protein complex have not yet been investigated. We therefore set up a mass spectrometry-based quantification method and used the hPrp19/CDC5L complex to implement the methodology of absolute quantification (AQUA) with the help of synthetic standard peptides in combination with multiple reaction monitoring (MRM). The analyses revealed that the hPrp19/CDC5L complex consists of four copies of hPrp19, two copies of CDC5L, and one copy each of SPF27, PRL1, and CTNNBL1. In a different series of investigation, we set out to make a high throughput relative quantification of two distinct spliceosomal complexes, namely the pre-catalytic and the catalytically active spliceosomes (spliceosomal B and C complexes). For this purpose, a relative quantification approach involving iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantification) labeling of in-gel digested proteins was optimized and applied to the two complexes. The results were compared to relative quantification by metabolic labeling (SILAC; stable isotope labeling with amino acids in cell culture) and semi-quantitative spectral count from proteomic analysis of the B and C complexes. We found an overall good agreement for the used quantification methods. Several proteins were found to be pre-dominantly associated with spliceosomal B or C complexes, and only few proteins were found to be present in equal amounts within the two complexes. The high dynamics of the spliceosome during its assembly pathway was thus clearly demonstrated. In a final scene of investigation, we analyzed the dynamic protein changes during the pre-mRNA splicing process. To this end, the protein compositions on different pre-mRNAs at different time points were compared by stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC). The generated timelines for the assembly of whole groups of spliceosomal proteins during spliceosomal assembly and splicing catalysis are extremely helpful in understanding the dynamic process of pre-mRNA splicing.
Keywords: mass spectrometry; absolute quantification; relative quantification; protein complexes
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Die Mehrzahl zellulärer Prozesse wird von
Proteinkomplexen angetrieben. Diese treten entweder als
multimere Proteinverbindungen oder komplexiert mit
Liganden wie zum Beispiel RNA- oder DNA-Molekülen auf.
Um die Details der zellulären Vorgänge zu verstehen ist
eine Analyse der Proteinkomplexe erforderlich. Diese
beinhaltet die Identifizierung der Proteinkomponenten,
der Bestimmung der Proteinstöchiometrien, die relative
Quantifizierung verschiedenener Komplexstadien sowie
die Analyse der Protein-Protein- und
Protein-Ligand-Interaktionen. Mehrere
massenspektrometrische Methoden wurden entwickelt um
diese Fragen zu beantworten und eine
Hochdurchsatz-Analse der Proteinkomplexe zu
ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden diese
Methoden auf das Spleißosom angewandt, welches eine
Protein-RNA-Maschinerie darstellt, die das
Herausschneiden von Introns und das Verbinden von Exons
während dem eukaryotischen prä-mRNA-Spleißen
katalysiert. Wir haben die absolute und die relative
Quantifizierung mittels Massenspektrometrie angewandt
um verschiedene spleißosomale Komplexe und Teilkomplexe
in Hinsicht auf ihre Proteinkomposition und ihre
Proteinstöchiometrie zu charakterisieren. Der
spleißosomale hPrp19/CDC5L-Komplex besteht aus sieben
Proteinen (hPrp19, Hsp70, CTNNBL1, PRL1, CDC5L, AD-002,
and SPF27) und spielt eine entscheidende Rolle im
Aufbau eines katytisch-aktiven Spleißosoms. Die genaue
Proteinstöchiometrie in diesem Komplex wurde bis jetzt
nicht erforscht. Aus diesem Grund haben wir eine
Massenspektrometrie-basierende Quantifizierungsmethode
aufgesetzt und haben den hPrp19/CDC5L-Komplex genutzt
um die Methodik der absoluten Quantifizierung (AQUA)
mit Hilfe von Standardpeptiden in Kombination mit
multiple reaction monitoring (MRM) zu etablieren. Die
Analysen haben ergeben, daß der hPrp19/CDC5L-Komplex
vier Kopien des hPrp19-Proteins, zwei Kopien des
CDC5L-Proteins und je eine Kopie der Proteine SPF27,
PRL1 und CTNNBL1 beinhaltet. In weiteren Studien haben
wir eine Hochdurchsatz-Quantifizierung zweier
spleißosomaler Komplexe, und zwar dem prä-katalytischen
und dem katalytisch-aktiven Spleißosom (spleißosomaler
Komplexe B und C), durchgeführt. Hierfür wurde eine
Methode der relativen Quantifizierung, welche die
Markierung mit iTRAQ-Reagenzien (isobaric tags for
relative and absolute quantification) von in-gel
hydrolysierten Proteinen beinhaltet, optimiert und zur
Quantifizierung der zwei Komplexe angewandt. Die
Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen der relativen
Quantifizierung mittels metabolischer Markierung
(SILAC; stable isotope labeling with amino acids in
cell culture) und der semi-quantitativen Spectral
Count-Methode verglichen. Hierbei haben wir haben eine
gute Übereinstimmung der eingesetzten Methoden
gefunden. Eine Vielzahl von Proteinen, welche
überwiegend mit dem B- oder C-Komplex assoziiert sind
und nur eine geringe Anzahl an Proteinen, welche in
gleichen Mengen in beiden Komplexen vertreten sind,
wurden identifiziert. Das dynamische Verhalten des
Spleißosoms während seiner Assemblierung wurde somit
verdeutlicht. Im abschließenden Teil dieser Arbeit
wurden die dynamischen Proteinänderungen während des
prä-mRNA-Spleißens untersucht. Hierfür wurden die
Proteinzusammensetzungen auf verschiedenen prä-mRNAs zu
verschiedenen Zeitpunkten mittels stable isotope
labeling with amino acids in cell culture (SILAC)
verglichen. Die generierten Zeitreihen für die
Assemblierung von spleißosomalen Proteingruppen während
des Spleißvorgangs sind hilfreich um den Vorgang des
prä-mRNA-Spleißens zu verstehen.
Schlagwörter: Massenspektrometrie; absolute Quantifizierung; relative Qauntifizierung; Proteinkomplexe