Molecular mechanism of Inhibition of the CREB-coactivator TORC by the mitogen-activated kinase DLK in pancreatic beta-cells

Abstract

Der ubiquitär exprimierte Transkriptionsfaktor CREB ist an zahlreichen zellulären Signaltransduktionswegen einschließlich der Regulation des Stoffwechsels, des Zellzyklus und überlebens, des Zellwachstums und der Immunregulation beteiligt. Drei Isoformen des Transducer of Regulated CREB (TORC) wurden kürzlich als weitere Kofaktoren von CREB identifiziert. Die Phosphorylierung von TORC2 am Ser-171 bzw. von TORC1 am Ser-167 führt zu einer Interaktion mit 14-3-3 Proteinen, wodurch TORC im Zytosol verbleibt. Die Dephosphorylierung dieser Aminosäuren resultiert in der nukleären Lokalisation von TORC, wo es mit dem homodimesierten Leuzin-Zipper von CREB interagiert und so die CREB-abhängige Gentranskription vermittelt. Eine frühere Untersuchung zeigte, daß die Dual Leucine Zipper Kinase DLK die durch Membrandepolarisation stimulierte CREB-abhängige Gentranskription in Beta-Zellen hemmte. Da die Rekrutierung von TORC notwendig für die volle transkriptionelle Aktivität von CREB ist, könnte TORC ein Ziel von DLK sein. In der vorliegenden Untersuchung wurde die Regulation von TORC durch die DLK untersucht. Hierzu wurde die Wirkung von DLK auf die transkriptionelle Aktivität von TORC in Beta-Zellen mittels Luciferasereportergenassays untersucht. Eine Interaktion zwischen DLK und TORC wurde durch in vitro Protein-Proteininteraktionsassays und Koimmunpräzipitation analysiert. Für die Untersuchungen zur Phosphorylierung von TORC durch DLK wurden Western Blot Analysen und in vitro Kinaseassays eingesetzt. Die Wirkung von DLK auf die nukleäre Translokation von TORC und die Rekrutierung an CRE enthaltende Promotoren wurde mittels immunzytochemischen Untersuchungen, Chromatinimmunpräzipitation und Luciferasereportergenassays untersucht. DLK hemmte die transkriptionelle Aktivität aller drei TORC Isoformen. Diese hemmende Wirkung war abhängig von der Fähigkeit DLK s zu homodimerisieren und von ihrer Kinaseaktivität. Der in vitro Kinase Assay zeigte, daß weder TORC1 noch TORC2 direkte Substrate der Kinase waren. Jedoch zeigte sich im Immunoblot, daß die Überexpression von DLK zu einer verstärkte Phosphorylierung von TORC1 am Ser-167 und an anderen nicht identifizierten Aminosäuren führte. Zusätzliche Behandlung der HIT Zellen mit einem Hemmstoff von JNK, einer der DLK untergeordneten Kinase, reduzierte die Phosphorylierung von TORC1 am Ser-167 und hob die langsamere Migration weiterer phospho-TORC1 Banden auf. Diese Daten lassen vermuten, daß DLK wahrscheinlich durch Aktvierung von JNK die Phosphorylierung von TORC induziert. Neben einer Phosphorylierung konnte mittels in vitro Protein-Protein Interaktionsassays und Koimmunpräzipitationen gezeigt werden, daß DLK mit TORC interagiert. Diese Interaktion war abhängig von der Fähigkeit DLK s zu homodimerisieren, da die DLK-PP Mutante in einem deutlich geringeren Ausmaß als DLK Wildtyp an das immobilisierte His-TORC Fusionsprotein band. Da DLK Wildtyp und seine Kinase-tote Mutante in demselben Ausmaß mit immobilisierten His-TORC Fusionsprotein interagierten, kann geschlossen werden, daß die Ausbildung eines Leuzin-Zippers notwendig für die DLK TORC Interaktion ist. Ebenfalls scheint die coiled-coil Stuktur, die durch die N-terminalen Domänen des TORC Tetramers gebildet wird, für die Interaktion mit dem Leuzin-Zipper von DLK erforderlich zu sein. In Abhängigkeit von seiner enzymatischen Aktivität verminderte DLK die nukleäre Lokalisation von TORC und die TORC-abhängige, CRE-dirigierte Gentranskription. Die Chromatinimmunpräzipitation zeigte, daß DLK die Rekrutierung von TORC an einen CRE enthaltenden Promotor verminderte. Zusammengefaßt zeigt die vorliegende Untersuchung, daß TORC ein Ziel der hemmenden Wirkung von DLK in Beta-Zellen ist. Die DLK induzierte Hemmung von TORC stellt einen neuen Signalweg dar, der durch Modifikation der CREB-abhängigen Gentranskription zur Regulation von Apoptose und Proliferation in Beta-Zellen beiträgt. Die Hemmung von DLK in Beta-Zellen könnte somit ein Ziel für die Therapie des Diabetes mellitus darstellen.