Crystal structure analysis of selenocysteine biosynthesis components

Abstract

Einige Organismen aus allen drei Domänen des Lebens Eukaryoten, Bakterien und Archaea - bauen Selenocystein (Sec) in Teile ihrer Proteine ein. Die Sec-Synthese findet an ihrer verwandten tRNASec statt, die zuerst mit Serin von der seryl-rRNAse-Synthase (SerRS) aminoacetyliert wird. Für die Umwandlung von Ser-tRNASec zu Sec-tRNASec in Bakterien ist die Selenocystein Synthase (SelA) verantwortlich, in Eukaryoten und Archaea sind es O-phospho-L-seryl-tRNASec kinase (PSTK) und Selenocystein Synthase (SecS). In Eukaryoten und Archaea ist SecS das letzte Enzym in der Sec Biosynthese. Es konvertiert O-phospho-L-seryl-tRNASec in Selenocysteyl-tRNASec unter Verwendung von Selenphosphat als Selen Donor. Die Kristallstruktur eines Fragmentes von 450 Resten des SecS aus Maus, das immer noch volle enzymatische Aktivität zeigten, wurde bei 1.65Å Auflösung gelöst. Das Protein ist aus der Familie der Faltungstyp I Familie der Pyridoxal-Phoshat (PLP)-Abhängigen Enzymen. Es besteht aus 3 Domänen die eine Nummer an Eigenschaften aufweisen, die bei keinem Enzym der Familie bisher gefunden wurde. Zwei SecS-Monomere interagieren eng miteinander und bilden zwei identische aktive Zentrem um einen PLP Cofaktor. Die Protomere tauschen gegenseitig ein langes SecS-spezifisches Insert der ersten Domäne, was das aktive Zentrum, verglichen mit anderen Faltungstyp I Enzymen, ändert. Zwei SecS Dimere bilden zusammen ein Homotetramer über die N-terminale Region, die einzigartig ist unter den SecS Orthologen. Ein detailierter Rekationsmechanismus für das Enzym basierend auf Aktivitätsprofielen von Inhibitoren wurde formuliert. tRNASec ist ein Schlüsselmolekül, das an allen Schritten des Biosyntheseweges beteiligt ist, in der Sec-Biosynthese und im Sec-Einbau. Um gut streuende Kristalle züchten zu können wurden rationelle Mutationen in murine tRNASec eingefügt. Kristallstrukturen von tRNASec ohne die Nukleotide 72-76 der Haarnadelstruktur des Akzeptors wurden bis zu einer Auflösung von 2.0 Å gelöst. Die Strukturen sind grob betrachtet identisch mit der humanen tRNASec die schon früher publiziert wurde. Unsere Struktur hingegen zeigt Details, die in der humanen Struktur bei 3.1Å verborgen blieben. Strukturelle Vergleiche der tRNASec Moleküle zeigte, dass der variable Arm und der Teil der Anticodon Haarnadelstruktur flexible Regionen sind, während hingegen der innere Teil des Moleküls steif ist. Möglicherweise spielen die flexiblen Teile der tRNASec eine Rolle bei der Kontaktherstellung mit interagierenden Proteinen. Die Anticodon-Schleifen von zwei tRNASec in der assymmetrischen Einheit nahmen eine 5- und 3- Nukleotid-Konformation ein. Wir kommen, basierend auf der Erstellung eines Modell von 2 -O-hydroxymethyierter Ribose an U34, zu dem Schluss, dass gänzlich modifizierte tRNASec die 5-Nukleotid Antikodon-Schleifen-Konformation favorisiert. Wassermoleküle 195 wurden lokalisiert, die sowohl die funktionalen Gruppen der Basen, als auch das Rückgrat kontaktieren. Interessanterweise sind Guanosine öfter hydriert als andere tRNASec Basen, was eventuell eine einzig dekorative chemische Funktionalität reflektiert. Soaking Experimente mit den Kristallen der tRNASec mit Mn2+ zeigen fünf putative Mg2+ bindestellen im Molekül. Alle gefundenen Metalle waren in Kontakt mit N7 Atomen von Guanosinen. Dennoch haben die Metallionen keine spezielle die 3D Struktur der tRNASec stabilisierende Funktion.