Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie und Rasterkorrelationsmikroskopie molekularer Prozesse in Nervenzellen

Abstract

Passive Diffusion von Molekülen und aktive Transportprozesse von Organellen sind in vielen zellulären Systemen von Interesse. Um zu verstehen, wie das intrazelluläre Milieu die Diffusion von Molekülen in verschiedenen zellulären Kompartimenten beeinflusst, wurde die Diffusion eines mit Farbstoff markierten Dextrans im Zytoplasma von kultivierten Neuronen aus dem Bulbus olfactorius von Xenopus laevis Kaulquappen unter Anwendung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) untersucht. Es wurde ein experimenteller Aufbau entwickelt, der die Vorteile der FCS und der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) vereint. Neue FCS- und CLSM-Algorithmen wurden hergeleitet, die es zum ersten Mal ermöglichten, Diffusionsprozesse von fluoreszierenden Molekülen in kleinen zytosolischen Kompartimenten von Neuronen mit einer hohen Präzision zu untersuchen. Mit dem für dieses Projekt entwickelten Gerät und den Algorithmen konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenzdaten von Dendriten am besten durch ein Modell für anisotrope Diffusion beschrieben werden. Im Vergleich zu wässriger Lösung ist die Diffusion eines 10 kDa TMR-Dextran entlang der Achse eines Dendriten um den Faktor 1.1 bis 2.1 verlangsamt, während die Diffusion in lateraler Richtung um den Faktor 10 bis 100 reduziert ist. Die Erklärung für die beobachtete Anisotropie ist sehr wahrscheinlich das intrazelluläre Netzwerk von Mikrotubuli, das parallel zur Fortpflanzungsrichtung des Dendriten ausgerichtet ist und die Diffusion quer zur Dendritenachse stark behindert, während es die Diffusion entlang des Dendriten kaum beeinflusst. In Zellkernen wurde eine isotrope Diffusion in allen drei Richtungen mit einer 1.2 bis 2.6fach reduzierten Diffusion im Vergleich zu wässriger Lösung beobachtet. Die Diffusion innerhalb der Zellkerne ist somit relativ ungehindert. In einem zweiten Teil des Projektes wurde die submikroskopische Mobilität von Organellen in Dendriten von kultivierten Neuronen untersucht. In der Fluoreszenzmikroskopie standen bis jetzt keine Algorithmen zur Verfügung, mit denen sowohl Organellen in lebenden Zellen in Abhängigkeit der Zeit lokalisiert als auch gleichzeitig Form- und Größenparameter mit einer Genauigkeit bis zu wenigen Nanometern bestimmt werden können. In diesem Projekt wurden zwei solche Algorithmen basierend auf der Faltungsprodukt- und Korrelationsanalyse von Fluoreszenzbildern entwickelt, die sowohl Position, Orientierung, Form und Größe der Objekte berücksichtigen. Die Genauigkeit beider Algorithmen wurde mit Hilfe von Computersimulationen quantitativ untersucht. Die entwickelten "Tracking"-Algorithmen wurden benutzt, um die submikroskopische Mobilität von mit Farbstoff markierten Mitochondrien in Dendriten zu untersuchen. Die Analysen zeigen eine Korrelation zwischen Bewegung und submikroskopischer Größenveränderungen von Mitochondrien. Die Beobachtung, dass sich das vordere und das hintere Ende eines Mitochondriums mitunter gleichzeitig in entgegengesetzte Richtungen bewegen, könnte ein Hinweis darauf sein, dass die entgegengesetzt gerichteten Motorproteine Kinesin und zytoplasmatisches Dynein gleichzeitig arbeiten können und somit zu Form- und Größenveränderungen eines transportieren Mitochondriums führen.