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Molecular motions at the 5 stem-loop of U4 snRNA: Implications for U4/U6 snRNP assembly

Molecular motions at the 5 stem-loop of U4 snRNA: Implications for U4/U6 snRNP assembly

by Vlad Cojocaru
Doctoral thesis
Date of Examination:2005-06-28
Date of issue:2005-07-05
Advisor:Dr. Thomas Jovin
Referee:Dr. Thomas Jovin
Referee:Prof. Dr. Reinhard Luehrmann
Referee:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1399

 

 

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Name:cojocaru.pdf
Size:4.04Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

The human 15.5K protein binds to the 5' stem-loop of U4 snRNA (KtU4), promotes the assembly of the spliceosomal U4/U6 snRNP, and is required for the recruitment of the 61K protein and the 20/60/90K protein complex to the U4 snRNA. In the crystallographic structure of the 15.5K-U4 snRNA complex, the RNA fold belongs to the family of kink turn (K-turn) motifs. This motif has a kink in the phosphodiester backbone that causes a sharp turn in the RNA helix. Two stems are connected by a purine-rich internal asymmetric loop, containing a flipped out uridine and two tandem sheared G-A base pairs. The shorter stem is attached to an external pentaloop. Using molecular dynamics simulations, I showed that the folding of KtU4 is assisted by protein binding. Conformational transitions such as the inter-conversion between alternative purine stacking schemes, the loss of G-A base pairs, and the opening of the K-turn (k-e motion) occurred only in the free RNA. The simulations provided the first atomic details of K-turn dynamics and were in excellent agreement with experimental data obtained by chemically probing the RNA structure and from single molecule FRET studies. In the free RNA, the k-e motion was triggered both by loss of G-A base pairs in the internal loop and backbone flexibility in the stems. However, the loss of G-A base pairs alone was insufficient for achieving a large opening of the free RNA. Essential dynamics showed that the loss of G-A base pairs is correlated along the first mode but anti-correlated along the third mode with the k-e motion. Based on these findings, I conclude that G-A base pair formation occurs upon binding to the 15.5K protein, thereby stabilizing a selective orientation of the stems.The external loop was not revealed in the crystallographic structure of the 15.5K- KtU4 complex. In the simulations, it adopted a specific orientation which did not persist in the unbound RNA and did not form when the natively occurring external loop was replaced by different loops or by an extended helix. I propose that the lack of stacking interactions between the last base pair of the stem and the adjacent nucleotide in the external loop are important for the correct folding of the RNA and might play a role in the subsequent binding of the 61K protein to the U4 snRNA.
Keywords: RNA Splicing; RNA K-turn motif; protein-assisted RNA folding; Molecular Dynamics Simulations; Locally Enhanced Sampling

Other Languages

Das humane 15.5K Protein bindet an die 5' Schleife der U4 snRNA (KtU4). Es begünstigt den Aufbau des Spliceosoms U4/U6 snRNP und ist notwendig für die Zusammenführung des 61K Proteins und des 20/60/90K Proteinkomplexes mit der U4-snRNA. In der kristallografischen Struktur des 15.5K-U4 snRNA Komplexes gehört die RNA Faltung zu der Familie der so genannten kink-turn (K-turn) Motive. Dieses Motiv ist durch einen scharfen Knick im Phosphodiesterrückgrat gekennzeichnet. Zwei Helixstämme sind durch eine purinreiche, asymmetrische, innere Schleife verbunden. Diese enthält eine herausgeklappte Uridinbase und zwei aufeinander folgende verschobene G-A Basenpaare. Der kürzere Helixstamm ist mit einer externen fünffachen Schleife verbunden. Mit Hilfe von Molekulardynamiksimulationen konnte ich zeigen, dass die Faltung von KtU4 durch die Proteinbindung unterstützt wird. Konformationsänderungen wie die Umwandlung zwischen alternativen Purin-Stapelschemata, der Verlust von G-A Basenpaaren und die Öffnung des K-turns (k-e Bewegung) trat nur in den Simulationen der ungebundenen RNA auf. Diese Simulationen zeigen zum ersten Mal die Dynamik des K-turn Motivs mit atomarer Auflösung und finden sich in hervorragender Übereinstimmung mit experimentellen Resultaten, die durch chemische Erprobung und FRET-Studien an Einzelmolekülen der RNA gesammelt wurden. In der ungebundenen RNA wurde die k-e Bewegung gleichermaßen durch den Verlust der G-A Basenpaare in der inneren Schleife und durch Flexibilität im Phosphatrückgrat der beiden Helixstämme hervorgerufen. Jedoch war der Verlust der G-A Basenpaare allein nicht ausreichend, um eine große Entfaltung der ungebundenen RNA zu erreichen. Eine Untersuchung der Eigenmodi der RNA Bewegung konnte zeigen, dass der Verlust der G-A Basenpaare nur mit dem ersten Eigenmodus korreliert ist aber nicht mit dem dritten Eigenmodus, der die k-e Bewegung beschreibt. Aufgrund dieser Ergebnisse komme ich zu dem Schluss, dass sich die G-A Basenpaare erst bei der Bindung an das 15.5K Protein bilden und d adurch selektiv die Ausrichtung der Helixstämme stabilisieren. Die externe Schleife konnte in der Kristallstruktur des 15.5K-KtU4 Komplexes nicht aufgelöst werden. In den Simulationen des Komplexes nahm sie eine bestimmte Orientierung ein, die nicht in der ungebundenen RNA beobachtet wurde. Sie trat auch dann nicht auf, wenn die natürliche Sequenz durch andere externe Schleifen ersetzt oder die Helixstämme verlängert wurden. Auf Grund der Simulationsergebnisse schlage ich vor, dass die nicht vorhandene Stapelung zwischen dem letzten Basenpaar des Helixstamms und dem benachbarten Nukleotid in der externen Schleife wichtig ist für die korrekte Faltung der RNA und eine wichtige Rolle in der nachfolgenden Bindung des 61K Proteins an die U4 snRNA spielt.
Schlagwörter: RNA Splicing; RNA K-turn motif; protein-assisted RNA folding; Molecular Dynamics Simulations; Locally Enhanced Sampling
 

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