Molecular motions at the 5 stem-loop of U4 snRNA: Implications for U4/U6 snRNP assembly

Abstract

Das humane 15.5K Protein bindet an die 5' Schleife der U4 snRNA (KtU4). Es begünstigt den Aufbau des Spliceosoms U4/U6 snRNP und ist notwendig für die Zusammenführung des 61K Proteins und des 20/60/90K Proteinkomplexes mit der U4-snRNA. In der kristallografischen Struktur des 15.5K-U4 snRNA Komplexes gehört die RNA Faltung zu der Familie der so genannten kink-turn (K-turn) Motive. Dieses Motiv ist durch einen scharfen Knick im Phosphodiesterrückgrat gekennzeichnet. Zwei Helixstämme sind durch eine purinreiche, asymmetrische, innere Schleife verbunden. Diese enthält eine herausgeklappte Uridinbase und zwei aufeinander folgende verschobene G-A Basenpaare. Der kürzere Helixstamm ist mit einer externen fünffachen Schleife verbunden. Mit Hilfe von Molekulardynamiksimulationen konnte ich zeigen, dass die Faltung von KtU4 durch die Proteinbindung unterstützt wird. Konformationsänderungen wie die Umwandlung zwischen alternativen Purin-Stapelschemata, der Verlust von G-A Basenpaaren und die Öffnung des K-turns (k-e Bewegung) trat nur in den Simulationen der ungebundenen RNA auf. Diese Simulationen zeigen zum ersten Mal die Dynamik des K-turn Motivs mit atomarer Auflösung und finden sich in hervorragender Übereinstimmung mit experimentellen Resultaten, die durch chemische Erprobung und FRET-Studien an Einzelmolekülen der RNA gesammelt wurden. In der ungebundenen RNA wurde die k-e Bewegung gleichermaßen durch den Verlust der G-A Basenpaare in der inneren Schleife und durch Flexibilität im Phosphatrückgrat der beiden Helixstämme hervorgerufen. Jedoch war der Verlust der G-A Basenpaare allein nicht ausreichend, um eine große Entfaltung der ungebundenen RNA zu erreichen. Eine Untersuchung der Eigenmodi der RNA Bewegung konnte zeigen, dass der Verlust der G-A Basenpaare nur mit dem ersten Eigenmodus korreliert ist aber nicht mit dem dritten Eigenmodus, der die k-e Bewegung beschreibt. Aufgrund dieser Ergebnisse komme ich zu dem Schluss, dass sich die G-A Basenpaare erst bei der Bindung an das 15.5K Protein bilden und d adurch selektiv die Ausrichtung der Helixstämme stabilisieren. Die externe Schleife konnte in der Kristallstruktur des 15.5K-KtU4 Komplexes nicht aufgelöst werden. In den Simulationen des Komplexes nahm sie eine bestimmte Orientierung ein, die nicht in der ungebundenen RNA beobachtet wurde. Sie trat auch dann nicht auf, wenn die natürliche Sequenz durch andere externe Schleifen ersetzt oder die Helixstämme verlängert wurden. Auf Grund der Simulationsergebnisse schlage ich vor, dass die nicht vorhandene Stapelung zwischen dem letzten Basenpaar des Helixstamms und dem benachbarten Nukleotid in der externen Schleife wichtig ist für die korrekte Faltung der RNA und eine wichtige Rolle in der nachfolgenden Bindung des 61K Proteins an die U4 snRNA spielt.