Nachweis und Aufreinigung von Abscisinsäure-bindenden Proteinen aus dem Cytosol von Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, cytosolische ABA-bindende Proteine aus Pflanzenextrakten zu isolieren und nachzuweisen. Dazu wurden Proteine aus Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen durch verschiedene proteinbiochemische Methoden wie Ammoniumsulfat-Fällung und Säulenchromatographie aufgereinigt. Für den Nachweis ABA-bindender Proteine wurde als Detektionsverfahren ein nicht-kompetitiver ELISA etabliert.

ABA-BSA-Konjugate wurden im ELISA als Sonden zum Nachweis ABA-bindender Proteine eingesetzt. Dazu wurde die Kopplung von ABA an BSA als Trägerprotein in dieser Arbeit durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß pro BSA-Molekül durchschnittlich 21 ABA-Moleküle gebunden wurden. Diese ABA-BSA-Konjugate wurden zur Immunisierung von zwei Kaninchen verwendet. Die gewonnenen polyklonalen Antikörper erwiesen sich als spezifisch gegenüber ABA. Aus Experimenten, bei denen die Konkurrenz von 3H-ABA und ABA um die Bindung an den Antikörper untersucht wurde, konnte ein Kd-Wert von 36,8 nM für den ABA/Antikörper-Komplex erhalten werden.

Eine Aufreinigung von Proteinen aus Spinatpflanzen mittels Gelfiltrations-Chromatographie ergab keine spezifische ABA-BSA-Konjugat Bindung. Von den durch Aufreinigung von Arabidopsis-Proteinen mittels Kationenaustauscher-Chromatographie erhaltenen Fraktionen zeigten mehrere eine hohe ABA-BSA-Konjugat-Bindung. Bei der weiteren Aufreinigung einer dieser Fraktionen durch ABA-Affinitäts-Chromatographie wurden zwei ABA-bindende Proteine mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und 52 kDa nachgewiesen.